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摘 要

本课题以自制的羧基功能化聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球为基质，填充色谱柱，装配在美国伯乐公司的全自动血红蛋白分析仪上，通过优化流动相组成、浓度、pH等条件，使该设备可以准确分析待测样本中的HbA1c值。本课题研制的色谱柱及其流动相配方，可以取代伯乐公司全自动糖化血红蛋白分析仪的进口配件耗材，最终降低待测样品的分析成本。通过对与灌注压力和装柱材料的比对，确定适当的灌注条件配比不同的流动相浓度和不同的流动相来确定流动相的条件，流动相A由一定浓度的磷酸盐缓冲液和Bis-Tris组成,在配置好流动相A后，用氢氧化钠或盐酸调至pH 6.0，流动相B为流动相A液加入一定浓度NaCl溶液，用氢氧化钠或盐酸调至pH为6.7。

关键词：聚甲基丙烯酸甲酯微球 高压液相 离子交换 流动相 磷酸盐缓冲液

Application of New Ion Chromatography Stationary Phase in the Analysis of Glycated Hemoglobin

Abstract

In this paper, the carboxyl functionalized poly (methyl methacrylate) (PMMA) microspheres made by ourselfs were used as the matrix to fill the chromatographic column, which was assembled on the Automatic Hemoglobin Analyzer of Bio-Rad company(USA). The HbA1c value of the sample could be accurately analyzed by optimized conditions, which were the composition, concentration and pH of the flow phase.The chromatographic column and its liquid phase formulation developed in this project can replace the imported parts of the Analyzer. Finally, the cost of the samples analysis can be reduced. After we optimized several conditions of the perfusion pressure, the column material and mobile phase composition,we can determine the conditions as follows. Flow phase A consist of a certain concentration of phosphate buffer and Bis-Tris. After diluted to a proper appropriate concentration, the flowing phase A was adjust to pH 6.0 with sodium hydroxide or hydrochloric acid.The flowing phase B was added a certain NaCl into the flowing phase A, and then was adjusted to pH 6.7 with sodium hydroxide or hydrochloric acid.

Key Words:Polymethyl methacrylate microspheres;High pressure liquid;Ion exchange；Mobile phas；Phosphate buffer

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1色谱法概述 1

1.2 固定相 1

1.3 色谱条件 1

1.3.1 流动相的组成 1

1.3.2 流动相的选择 2

1.3.3 流动相PH的选择 2

1.3.5 流速的选择 2

1.3.6 温度的选择 2

1.4 本课题完成的意义和拟完成的任务 3

第二章 功能化聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备和色谱分析条件的试验方法

2.1 前言 3

2.2 实验材料 3

2.2.1 主要实验试剂 4

2.2.2 主要实验仪器 4

2.3 试验方法 5

2.3.1 功能化聚甲基丙烯酸甲酯微球的合成 5

2.2.2 微球羧基含量的检测 6

2.2.3 色谱的装柱 6

2.2.4 磷酸盐缓冲液的配置 6

2.2.5 PH计的校准 7

2.2.6 色谱流动相的确定 7

第三章 功能化聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备和色谱分析条件的结果与讨论

3.1 功能化聚甲基丙烯酸甲酯微球制备的表征 9

3.2 功能化聚甲基丙烯酸甲酯微球色谱柱性能的研究 10

3.3 流动相A的优化 10

3.4 流动相B的优化 16

第四章 结论与展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 文献综述

1.1色谱法概述

自上一个世纪开始，色谱作为一种高效快速的分离方法逐渐在各个科学领域得到了重视以及应用，并且作为一种必不可缺的科学手段和有效工具得到了越来越普遍的应用。据统计，在目前的分析方法中，色谱分析的比重己经达到了70%。目前其中发展最好，应用最为广泛的主要是气相色谱和液相色谱。气相色谱主要适用于分析沸点或蒸气压低的样品，对高沸点或热稳定性差的化合物则不大适用。目前我们已知的大部分化合物均可使用液相色谱进行分离，所以液相色谱的应用比起色相色谱更加广泛一点。所以，在目前，高翔液相色谱法得到了较快的发展和较高的应用面^[1]。

高效液相色谱是一种功能强大的分析方法，主要用于有机物分离，如生物大分子，药物小分子包括手性物质的分离等。该方法已被应用于各种实验结果的检测，包括蛋白水解片段的分离。HPLC也是一个强大的分析工具。可以用来分析抗体 - 药物偶联物。高效液相色谱的分离速度比传统色谱法快了数百倍，最快流速可以达到10 ml/min^[2]。

高效液相离子交换色谱法是目前分离生物大分子的常见的分离方法，其原理主要为以带有阳离子或者阴离子的交换树脂为填料，以盐类缓冲液为流动相，根据被分离物的表面电荷的不同进行分离^[3]。

血红蛋白可以有许多的常规测量方法进行分析，根据不同的分析原理，可以分为免疫比浊法，离子交换色谱法和亲和层析色谱法等。诊断方法的选择取决于当地的考虑因素，如成本，设备可用性，群体特征，是否存在国家质量保证体系等。虽然高效液相色谱法是检测糖化血红蛋白的金标准方法，但缺点就在检测时间太长且只能单个样进行检测。

1.2 固定相

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