论文总字数：20745字

摘 要

长链不饱和脂肪酸，包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）等，它是人体的必需脂肪酸(Essential Fatty Acid)，对人体正常生长发育有许多重要生理功能，并且有助于防治心血管疾病、保护视力、增强免疫力、促进生长发育等。传统生产EPA方式是从深海鱼中的鱼油中提取，但随着市场需求增大，这种生产方式已经不能满足商业需要，利用海洋微生物发酵生产EPA是一条可行的新生产途径。

温度会显著影响微生物细胞组成生长和脂肪酸含量。生物细胞中的脂肪酸含量会影响细胞膜的流动性。在低温环境中，微生物需要提高细胞膜中不饱和脂肪酸的含量来提高膜的流动性，以此来维持各项生命活动正常进行。

裂殖壶菌是一种低等海洋真菌，它具有易培养，生长周期短以及脂肪酸组成简单等特点。目前国内生产EPA面临多种问题，发酵生产成本较高以及产品产率低的问题尤为突出。为了解决这些问题，优化发酵条件并培育出高产EPA菌株成为了目前研究的重点。对此，本文对裂殖壶菌作了以下研究：

1. 考察不同温度下裂殖壶菌的生长情况以及发酵生产EPA含量变化

2、在不同温度梯度下培养裂殖壶菌，测定原始菌在不同温度下的葡萄糖消耗量、油脂产量以及生产的EPA百分比含量，绘制原始菌生长曲线和糖耗曲线。

3、分析确定最适低温条件，在该温度条件下连续驯化培养裂殖壶菌，测定不同驯化菌的生长曲线、葡萄糖消耗量、油脂产量以及生产的EPA百分比含量，筛选出一株高产EPA的菌株。

4、分析原始菌株与高产菌株的代谢差异，剖析高产菌株的低温调控原理。

本次实验最后通过连续低温驯化获得了一株高产EPA的裂殖壶菌菌株，EPA含量比原始菌提高了约60%。该驯化菌的生理代谢比原始菌更加旺盛，生长周期更短。此次实验驯化方案的成功也给今后的实验提供了思路。

Abstract

Long-chain unsaturated fatty acids, including Eicosapentaenoic Acid (EPA) and Docosahexaenoic acid (DHA), are essential fatty acids in the human body and are normal to the human body. There are many important physiological functions in growth and development, and it helps to prevent and treat cardiovascular diseases, protect vision, enhance immunity, and promote growth and development. The traditional way of producing EPA is to extract fish oil from deep sea fish, but as the market demand increases, this production method can no longer meet commercial needs. The use of marine microorganisms to produce EPA by fermentation is a viable new production route.

Temperature can significantly affect microbial cell composition growth and fatty acid content. The fatty acid content in biological cells affects the fluidity of the cell membrane. In a low-temperature environment, microorganisms need to increase the content of unsaturated fatty acids in the cell membrane to improve the fluidity of the membrane to maintain normal life activities.

Schizochytrium is a kind of low-level marine fungus, which has the characteristics of easy culture, short growth cycle and simple fatty acid composition. At present, the domestic production of EPA is faced with a variety of problems. The problem of high fermentation production costs and low product yield is particularly acute. In order to solve these problems, optimizing fermentation conditions and cultivating high-yield EPA strains have become the focus of current research. In this regard, the following studies were performed on Schizochytrium:

1、Examine the growth of Schizochytrium at different temperatures and the change of EPA content in fermentation production.

2、The Schizochytrium was cultivated under different temperature gradients. The glucose consumption, oil production, and percentage of EPA produced at different temperatures were measured. The growth curve and sugar consumption curve of the original bacteria were plotted.

3、Analyze and determine the optimum low-temperature condition. Under this temperature condition, continuously cultivate the Schizochytrium, determine the growth curves, glucose consumption, oil production and the percentage of EPA produced by different domesticated bacteria, and screen out a high-yield EPA strain.

4、The metabolic differences between the original and high-yield strains were analyzed, and the principle of low-temperature control of high-yield strains was analyzed.

At the end of this experiment, a strain of Schizochytrium with high EPA production was obtained through continuous low-temperature acclimation. The EPA content was increased by about 60% compared with the original bacteria. The physiological metabolism of the domesticated bacteria is more prosperous than the original bacteria, and the growth cycle is shorter. The success of this experimental domestication program also provides ideas for future experiments.

目 录

摘要 i

Abstract ii

目录 I

第一章 综述 1

1.1 ω-3不饱和脂肪酸研究进展 1

1.2微生物生物合成EPA和DHA代谢途径 3

1.3EPA生产菌——裂殖壶菌研究近况 4

1.4微生物温度适应机制的研究 5

1.5研究目的及意义 6

第二章 实验材料与方法 8

2.1前言 8

2.2实验材料与仪器 9

2.2.1 实验试剂 9

2.2.2实验仪器 10

2.2.3实验菌株 11

2.2.4培养基 11

2.3实验方法 11

2.3.1培养方法 11

2.3.2无菌处理 12

2.3.3转接操作 13

2.4 裂殖壶菌的生物量、总脂含量及脂肪酸组成的测定 13

2.4.1 细胞葡萄糖消耗量测定 13

2.4.2细胞生物量的测定 13

2.4.3油脂含量测定 13

2.4.4脂肪酸组分分析 14

第三章 结果与讨论 15

3.1结果与分析 15

3.1.1不同温度胁迫条件下裂殖壶菌发酵性能变化 15

3.1.2 不同驯化方法对裂殖壶菌发酵性能的影响 18

3.2讨论 21

总 结 22

参考文献 23

致 谢 26

第一章 综述

1.1 ω-3不饱和脂肪酸研究进展

二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA）属于ω-3系列长链不饱和脂肪酸（ω-3 Very long chain polyunsaturated fatty acids, ω-3 VLC-PUFAs)，它广泛存在于海洋动物及植物性浮游生物中。EPA是人体的必需脂肪酸(Essential Fatty Acid)，对调节人体正常生长发育和防治心血管疾病有很多重要作用^[1]。研究表明，和饱和脂肪酸相比，EPA等ω-3不饱和脂肪酸具有更多功效，它们可以降低血液中甘油三酯和胆固醇含量，可降低血液黏度，促进血液循环，降低心脏病发生概率^[2]。同时，它们还有抗炎、抗血栓形成、预防和减少动脉硬化形成、增强免疫力、促进新生儿大脑发育和视力发育以及抑制乳腺肿瘤等生理作用。具体来说：第一，长链不饱和脂肪酸（PUFAs）是细胞膜磷脂的重要组成成分，能够维持细胞膜正常功能并促进膜流动。PUFAs成分和含量的改变会影响细胞膜流动性、激素与受体结合以及通过膜的信号传导等。第二，PUFAs具有抗炎作用，它能显著降低炎症因子活性从而有效治疗多种炎症疾病。它的抗炎作用主要是通过抑制部分细胞的5-脂氧化酶代谢途径并增加白三烯B5的合成来实现的。摄入PUFAs，可避免应激反应导致的机体免疫系统损害，有效增加机体的应激与抗感染能力^[3,4]。第三，PUFAs具有预防心血管疾病的作用，研究发现，血液中的低密度脂蛋白与极低密度脂蛋白会导致心血管疾病发生^[5]。PUFAs能显著降低甘油三酯含量、抑制胆固醇合成，升高高密度脂蛋白，抑制血小板凝结，促进血液流动，从而有效预防多种心血管疾病发生^[6,7]。第四，PUFAs是人脑神经细胞膜的主要组成成分，能够给脑部各种神经提供营养。EPA和DHA对婴幼儿视觉形成和大脑发育有重要作用，是维持其大脑与视力正常功能的必需脂肪酸^[8]。摄入EPA和DHA能有效降低精神疾病的发病率，修复受损脑细胞，抑制感官衰退与大脑老化^[9]。第五，PUFAs可以预防癌症，众多研究显示，含有ω-3系列长链不饱和脂肪酸的食物可以抑制乳腺癌、肠癌等癌症的发生、增长与转移^[10]。爱斯基摩女性因为长时间摄入富含PUFAs的海洋产品，患乳腺癌的概率大大低于其他女性^[11]。

传统的EPA生产方式是从脂肪含量较高的深海鱼类中提取。其中，鱼油是EPA与DHA生产的主要来源。深海鱼（列如沙丁鱼、金枪鱼）的油脂中含有大量的EPA、DHA。它们的提取的鱼油在食品工业中广泛利用，列如各种营养添加剂、婴幼儿及孕妇营养品、老年人保健食品。虽然，我国海洋资源丰富，传统的EPA生产方法可以被广泛使用。但是，这种生产方法依旧有许多问题，比如经济因素中加工成本过高，产品质量因素中胆固醇含量过高，鱼腥味较重等，并且，传统的生产方式比较受季节和地点环境的影响，难以保证稳定的产量。近些年，随着环境污染问题日趋严重，传统生产方式的产量受到影响，难以维持市场的大量需求。在这种情况下，寻找一个新的生产方式来改进或改变目前食用不饱和脂肪酸生产现状变得十分重要^[12]。其中，利用各种海洋微生物，特别是裂殖壶菌、寇氏隐甲藻等作为传统海洋鱼类的代替品来发酵生产EPA被视为一条有开发前景与价值的新生产途径^[13]。微生物生产，相较于传统生产方法，具有培养简单，生长周期短，不受地理环境限制，产物脂肪酸组成简单等优点。利用筛选、优化发酵和培养条件可以提高微生物生产EPA和DHA的生产效率。其中，温度对微生物发酵生产DHA和EPA有明显影响。近些年研究显示，低温驯化的菌株有更高的DHA及EPA产量。

1.2微生物生物合成EPA和DHA代谢途径

图1-1微生物合成不饱和脂肪酸途径

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