论文总字数：19473字

摘 要

细胞色素P450单加氧酶是在几乎所有生物体内都含有的天然的自给自足型聚合蛋白，它们催化了广泛的氧化反应，包括脂族和芳烃羟基化、双键环氧化、氧化酚醛耦合、脱烷基化和多重氧化，包括碳碳键断裂。在生物催化方面，作为一种氧化催化剂，P450具有催化条件温和、很高的反应选择性等催化特性的优势。本实验选取了来自红球菌的P450基因片段，利用pTrc-99a和PET-28a作为P450基因表达载体，利用限制性内切酶、连接酶、PCR、核酸电泳等相关的工具和技术，将目的基因片段P450构建在不同的表达载体质粒上。接着构建表达重组菌株，将构建好的重组质粒转化入不同的宿主大肠杆菌（Trans1-T1、AFP111、MG1655、BL21(DE3)、JM109、W3110、TransB）中，并利用SDS-PAGE蛋白电泳技术观察不同宿主对于酶的表达的影响，寻找最优宿主，实现最优蛋白表达量。在寻找到合适宿主后，探究不同的诱导表达条件，如诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间等对于酶表达的影响，找出最优条件组合以实现酶的高效制备。利用荧光分光光度计检测该酶单位时间内利用7-乙氧基香豆素生产7-羟基香豆素的量，测定不同反应时刻的产物的浓度，寻找最优产酶条件。

关键词：P450 重组质粒 诱导 蛋白表达

Cloning, expression, and characterization of cytochrome P450 monooxygenase

Abstract

Cytochrome P450 monooxygenases are natural self-sufficient fusion proteins found in almost all living organisms.They catalyze a wide range of oxidation reactions, including aliphatic and aromatic hydroxylation, epoxidation of double bonds,oxidative phenolic coupling, dealkylation, and multiple oxidation including carbon–carbon bond cleavage.In the field of biocatalysis, as an oxidation catalyst, P450 has the advantages of catalytic conditions such as mild catalytic conditions and high reaction selectivity.In this experiment, pTrc-99a and PET-28a were selected as P450 gene expression vectors.By using the relevant tools and techniques such as restriction enzyme, ligase, PCR, and nucleic acid electrophoresis, the target gene fragment P450 was constructed on different expression vector plasmids.constructing an expression recombinant strain and transforming the constructed recombinant plasmid into different host Escherichia coli（Trans1-T1、AFP111、MG1655、 BL21(DE3)、JM109、W3110、TransB）are as followed. SDS-PAGE protein electrophoresis was used to verify the effect of different hosts on enzyme expression and find the best host for achieving the highest protein expression.After finding a suitable host, explore different inducible expression conditions, such as induction temperature, induced pH, concentration of inducer, and induction time, and find out the optimal combination of conditions to achieve efficient enzyme preparation.The concentration of the substrate and the product at different reaction times was measured using a fluorescence spectrophotometer to verify the activity of the enzyme.

Key Words: P450; recombinant plasmid; induction;protein expression

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 课题研究背景 1

1.1.1 细胞色素P450的简介 1

1.1.2 细胞色素P450的催化特性 1

1.2 课题研究意义 2

1.3 P450的优化表达思路 2

第二章 实验部分 4

2.1实验材料 4

2.1.1 菌株与质粒 4

2.1.2 实验试剂 4

2.1.3 实验仪器 5

2.1.4 工具酶和试剂盒 6

2.1.5 培养基与缓冲液 6

2.1.5.1 培养基 6

2.1.5.2 缓冲液 6

2.2 细胞色素P450重组基因的构建 6

2.2.1 载体质粒、宿主的选择 6

2.2.2 P450单加氧酶基因PCR扩增 7

2.2.3 重组质粒的构建 7

2.3.4 重组基因的鉴定 8

2.3 细胞色素P450单加氧酶的表达验证及优化 9

2.3.1 实验原理 9

2.3.2 不同表达载体的诱导过程 9

2.3.3 7-羟基香豆素标准曲线的绘制 10

2.3.4 P450单加氧酶的蛋白胶验证 11

2.3.4.1 SDS-PAGE蛋白凝胶配制 11

2.3.4.2 超声波破碎 12

2.3.4.1 蛋白质变性及电泳 12

2.3.5 反应体系的构建及最佳表达载体的确定 12

2.4 细胞色素P450单加氧酶在表达时诱导条件的优化 12

2.3.1 验证诱导剂浓度对P450基因表达量的影响 12

2.3.2 验证诱导温度对P450基因表达量的影响 13

2.3.3 验证诱导时机对P450基因表达量的影响 13

第三章 结果与分析 15

3.1 重组质粒的验证 15

3.1.1 PCR验证 15

3.1.2 菌落PCR验证 15

3.1.3 重组质粒的单酶切验证 16

3.2 表达载体的筛选 17

3.3 诱导条件的筛选 17

3.3.1 诱导剂浓度对P450单加氧酶表达的影响 17

3.3.2 诱导温度对P450单加氧酶表达的影响 18

3.3.3 诱导时机对P450单加氧酶表达的影响 19

3.4 结论 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

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