论文总字数：18636字

摘 要

ω-转氨酶是一种转移酶，是用于催化氨基与酮交换的一种酶。手性胺是一种重要的医药中间体，ω-转氨酶的催化过程是以酮为底物，通过转氨作用能够快速有效地制备手性化合物。因此，我们很有必要研究ω-转氨酶的筛选方法。此外，因为底物相对便宜，产物的纯度相对较高，ω-转氨酶越来越受到研究人员的关注。

本论文从ω-转氨酶的基础概念说起，讲述了它在手性胺方面的重要应用以及目前为止所研究出的一些常用的ω-转氨酶筛选方法，但是都有一定程度上的缺陷。所以本实验利用基因挖掘技术，从基因组数据库中得到Rhizobium sp.AC27/96转氨酶，先将其进行表达纯化，然后用了一种快速高效的方法将其筛选出来，判断出它是否具备转氨酶活性后对它进行酶活的测定。

最后总结了本实验的研究成果，并且对ω-转氨酶的应用前景进行展望，分析它在有机合成中的重要应用。

关键词：ω-转氨酶 手性胺 基因挖掘 高通量

High-throughput screening of omega-transaminases

Abstract

Omega-transaminase is a transferase, like other transaminases, is a process of catalyzing the exchange of amino groups with ketones.The chiral amines are another important class of pharmaceutical intermediates.Omega-transaminase to ketones as raw materials, through the stereoselective transamination effect, can efficiently produce chiral amine.Therefore, it is necessary to study the screening method of omega-transaminase.Because the reaction of the substrate is relatively cheap, relatively high purity of the product characteristics, gradually by the researchers attention.

In this paper, from the basic concept of omega-aminotransferase, describing its important applications in chiral amines and some of the commonly used omega-transaminase screening methods that have been developed so far, but all these methods have some flaws.Therefore, this study uses gene mining technology, from the genome database to obtain Rhizobium sp.AC27 / 96 transaminase. It was purified and then purified by a rapid and efficient method to determine its activity and then to determine its activity.

Finally, the research results of this experiment are summarized, and the application prospect of ω-aminotransferase is prospected, and its important application in organic synthesis is analyzed.

Key Words:Omega-transaminase Chiral amines Gene mining High-throughput

目录

第一章 文献综述 1

1.1 ω-转氨酶的简介 1

1.2 ω-转氨酶的催化机制 1

1.3 ω-转氨酶的应用 1

1.3.1 手性胺类药物 2

1.3.2 手性胺的制备 2

1.4 ω-转氨酶筛选方法的研究进展 3

1.4.1 乳酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶 4

1.4.2 邻苯二甲胺法 5

1.4.3 硫酸铜法 5

1.5 研究意义和主要内容 6

1.5.1 研究意义 6

1.5.2 主要内容 6

第二章 ω-转氨酶的表达纯化 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 试剂和仪器 7

2.1.2 培养基 7

2.2 实验过程 8

2.2.1 培养过程 8

2.2.2粗酶液的制备 8

2.2.3 转氨酶的纯化 8

2.2.4 SDS-PAGE电泳检测 9

2.2.5蛋白含量测定 10

第三章 ω-转氨酶的筛选 12

3.1 实验材料 12

3.2 筛选过程 12

3.3 实验结果 12

第四章 酶活的测定 13

4.1反应体系 13

4.2 实验结果 14

第五章 底物谱的测定 15

5.1 氨基受体底物谱 15

5.1.1 反应体系 15

5.1.2 实验结果 16

5.2 氨基供体底物谱 17

5.2.1 反应体系 17

5.2.2 实验结果 18

第六章 结果讨论与前景展望 22

6.1 结果讨论 22

6.1.1 表达纯化 22

6.1.2 酶活的测定 22

6.1.3 底物谱的测定 22

6.2 前景展望 22

参考文献 24

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1 ω-转氨酶的简介

转氨酶是一种催化将某些基团从供体化合物转移到受体化合物的酶。在自然界中，许多代谢途径转氨酶都有涉及，而且转氨酶的转氨反应是可逆的。目前来看，在手性胺类化合物的不对称合成和动力学拆分以及外消旋方面，转氨酶都是至关重要的生物酶。S型转氨酶和R型转氨酶是工业化过程中最常用的转氨酶^[1-3]。

从转氨酶作用底物的差别可以看出，转氨酶有α-转氨酶和ω-转氨酶两种。ω-转氨酶跟α-转氨酶不一样的是，在ω-转氨酶参与的催化反应中，两个底物中至少有一个底物为α-氨基酸或者非α-酮酸^[4-5]。ω-转氨酶最主要的作用是可以利用动力学拆分或者不对称合成的方式合成手性胺类化合物。因为在很多行业大约有近一半的具有生物活性物质都含有手性胺，所以，ω-转氨酶作为生物催化剂有着关键的作用^[6]。另外，ω-转氨酶与其他催化酶相比，有很大的优势，例如立体选择性高，反应成本低、转化率高、没有额外辅因子。

1.2 ω-转氨酶的催化机制

ω-转氨酶催化将某种基团从氨基供体转移到氨基受体的反应过程，催化机制如下：第一步，底物的氨基和磷酸吡哆荃的酮基交换，生成磷酸吡哆胺和酮类化合物；第二步，底物酮和磷酸吡哆胺发生酮基和氨基互换，得到目的产物，磷酸吡哆胺也恢复成磷酸吡哆荃，可以重新投入到反应中 ^[7]。

1.3 ω-转氨酶的应用

光学纯的手性胺在制药领域和化工领域都是非常有价值的中间体。而用化学方法来制备这种光学纯的手性胺往往有很多缺点。例如，昂贵的过渡金属由于立体选择性较低，会导致反应的产量变低。将更有效和可持续的生物技术与以酶为基础的生物过程相结合，代替合成化学方法，近年来受到了很多的关注^[8-9]。

1.3.1 手性胺类药物

手性药物是指含有手性中心的药物分子结构，有两个互为镜像的对映异构体，这两种对映异构体并不完全相同，但是性质相像性很高，根据他们不同的旋光性分别命名为S型（左旋）、R型（右旋）以及外消旋^[10]。手性药物的其中一种异构体是不具有生物活性的，并且很可能会在代谢反应中产生副作用，这种副作用是有毒性的。手性药物的重要性就反映在手性药物的高光学纯度上，不仅能使药物作用最大化，而且可以可以让药物特异性得到改善，从而降低药物剂量以减少药物代谢负荷，最重要的是可以有效的避免有害对映异构体的副作用产生^[11]。

手性胺是合成许多手性药物的重要中间体，可用于神经类、心血管类、抗高血压类、抗感染类、抗糖尿病类等药物的生产^[12-13]。抗糖尿病新药的主要成分就是西他列汀^[14]。西他列汀（Sitagliptin），分子式为C16H15F6N5O。西他列汀是由美国默克公司研发的二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）的抑制剂。因为西他列汀不会增加糖尿病患者体重，又不会增加低血糖风险低，而且疗效很好，所以它很有可能会取代传统治疗药物从而变成最具有发展前景的临床抗糖尿病药物^[15]。

1.3.2 手性胺的制备

1. 动力学拆分制备手性胺这个反应的本质也是转氨反应，是指在适宜的氨基受体存在的情况下ω-转氨酶催化外消旋胺生成光学纯手性胺的过程^[16]。用化学当量的氨基供体即丙酮酸（或者其它α－酮酸）是动力学拆分手性胺前体最快速有效的方法^[17]。这个反应的优点是只需要ω-转氨酶，缺点是产物酮和受体酮会对反应产生强烈的抑制作用。而且生成的产物胺也会给之后的分离和纯化带来一定的问题。通过研究发现，可以用以下办法来解决底物抑制和产物分离的问题；移除产物酮，或者降低受体浓度，依靠产物胺的循环来得到受体酮^[19]。

（二）不对称合成是指在适宜的氨基供体存在的情况下，转氨酶催化前手性酮生成对应的手性胺的过程。这一过程又可以分为两种，酶一步合成法和化学-酶合成法^[18]。理论上手性胺不对称合成的转化率可以高达百分之百，这是手性拆分的主要优点。然而，转氨酶催化的手性胺的不对称合成过程是可逆的，使得反应平衡可以由过量的氨基供体或除去副产物来推动^[20]。基于氨基供体的化学性质，它在反应体系中积累到一定程度会对反应造成不好的影响，因为它可能超过氨基供体的最大溶解度。由于异丙胺价格相对合理而且容易获得，很多药物相关的胺化合物如西他列汀常常用异丙胺作为氨基供体来合成^[21]。

1.4 ω-转氨酶筛选方法的研究进展

目前已经研究出的很多的ω-转氨酶的筛选方法，都是将苯乙酮作为氨基受体将苯乙胺作为氨基供体进行的，在培养基中以苯乙酮作为碳源，以苯乙胺作为氮源对菌株进行筛选，或者直接采用NCBI中的信息，构建质粒后对它进行表达和纯化，再检测它的酶学性质及后续的底物谱的研究。采用苯乙酮作为底物的主要原因有以下几点：（1）苯乙酮和苯乙胺都是结构简单而且非常具代表性的合成砌块；（2）芳香族的转氨反应因为苯乙酮不溶于水、苯乙胺在反应过程中会抑制酶活会使得反应不向正向移动，进行起来会比较麻烦；（3）一旦使用苯乙酮作为底物催化转氨反应可以顺利进行，那么很多氨基供体都可以成功反应；（4）因为底物自带的苯环有紫外吸收峰，与脂肪胺类化合物相比，没有了柱前衍生化的操作，简化了操作步骤从而提高了效率^[22]。

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