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摘 要

为了考察氨甲酰磷酸合成酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-瓜氨酸的影响，以Corynebacterium glutamicum ATCC 13032基因组为模板克隆carAB并与载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-carAB，将重组质粒转入出发菌株C. glutamicum ATCC 13032∆argG∆argR后，通过摇瓶发酵研究重组质粒对菌体的生长及L-瓜氨酸产量的影响。结果显示，工程菌C. glutamicum ATCC 13032∆argG∆argR pXMJ19-carAB的L-瓜氨酸产量为6.30±0.18 g/L，与出发菌株相比，提高了16.0%。这说明过表达操纵子基因carAB可促进L-瓜氨酸的积累。

关键词：谷氨酸棒杆菌；氨甲酰磷酸合成酶；L-瓜氨酸；过表达

ABSTRACT

To study the effects of carbamoyl phosphate synthetase on L-citrulline fermentation of Corynebacterium glutamicum, carAB was amplified by PCR from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 chromosome and ligated into the pXMJ19 vector. Then the recombinant plasmids pXMJ19-carAB was transformed into C. glutamicum ATCC 13032∆argG∆argR. And the effects of pXMJ19-carAB on cell growth and L-citrulline production were studied by fermentation experiments. The results suggested that L-citrulline production of C. glutamicum ATCC 13032∆argG∆argR pXMJ19-carAB was 6.30±0.18 g/L, which was increased by 16.0% compared with C. glutamicum ATCC 13032∆argG∆argR. It shows that overexpressing carAB operon can promote the accumulation of L-citrulline.

Key words: Corynebacterium glutamicum, Carbamoyl phosphate synthase, L- citrulline, Overexpression

目录

摘要 II

ABSTRACT III

目录 1

第1章 绪论 1

1.1 L-瓜氨酸的基本性质 1

1.1.1 L-瓜氨酸的理化性质 1

1.1.2 L-瓜氨酸的应用 1

1.2 L-瓜氨酸的生产方式 2

1.3 L-瓜氨酸的合成代谢途径及代谢调控 3

1.4 谷氨酸棒杆菌氨甲酰磷酸途径研究概况 6

1.5 本论文的研究目的和内容 9

第2章 材料与方法 10

2.1 菌种、质粒和引物 10

2.2 主要试剂和仪器 11

2.3 培养基与培养条件 14

2.3.1 培养基 14

2.3.2 培养条件 14

2.4 谷氨酸棒杆菌染色体的提取 15

2.5 基因扩增及PCR产物回收 16

2.6 重组质粒的构建 16

2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 16

2.8 谷氨酸棒杆菌感受态的制备与转化 17

2.9 分析方法 18

2.9.1 菌体生长量及葡萄糖含量测定 18

2.9.2 氨基酸含量的测定 18

第3章 结果与讨论 20

3.1 质粒pXMJ19-carAB的构建及其酶切验证 20

3.2 重组质粒pXMJ19-carAB诱导表达 20

3.3 重组质粒对菌体生长与耗糖的影响 20

3.4 重组质粒对菌体L-瓜氨酸积累的影响 21

第4章 结论与展望 22

参考文献 23

致谢 29

第1章 绪论

1.1 L-瓜氨酸的基本性质

1.1.1 L-瓜氨酸的理化性质

瓜氨酸（Citrulline）是一种α-氨基酸，因1914年右贺太郎等第一次从西瓜中获取而得名为“瓜氨酸”。后来游离态的瓜氨酸在野生西瓜叶片、核桃仁、核桃幼苗等葫芦科植物的种子中被发现。其化学名为2-氨基-5-脲戊酸或脲氨基戊酸，分子式为C₆H₁₃N₃O₃，相对分子量为175.2，瓜氨酸熔点为222°C，等电点为5.92，比旋光度 [α]_D²⁵＝21.0。瓜氨酸纯品呈白色结晶状，有酸味，微溶于水，不溶于乙醇和乙醚^[1]。L-瓜氨酸的化学结构式如下图。

图1-1 L-瓜氨酸结构式

Fig. 1-1 Structure of L-citrulline

1.1.2 L-瓜氨酸的应用

L-瓜氨酸为非蛋白质氨基酸，在生物体代谢中起到重要作用。主要参与人体尿素循环，是尿素形成的重要中间产物，对于维持人体血氨平衡具有重要的作用^[2]。尿素循环（Ornithine cycle）是第一个被证明以循环方式存在的代谢途径，又称Krebs-Henseleit循环，促进氨态氮的排出进而维持血液中低浓度的氨态氮，解除体内的氨毒，因此对人体肝脏细胞具有重要意义。1932年，尿素合成的循环机制由Hans Krebs和Kurt Henseleit提出，见图1-2。

图1-2 尿素循环

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