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摘 要

本文主要研究固定腺苷酸环化酶制备cAMP的应用，研究内容主要包括固定工艺条件的优化、固定化酶学性质与固定化酶稳定性这三方面的研究。

在工艺上，取酶固比（mL·g^-1）=1，Ni² 量与载体的比例为5.0×10^-2 mol/g、固定化时间为4 h、固定化pH=8.0、固定化温度25 °C。固定化方法为一步纯化加固定，单位载体酶活达到235 U·g-1。在酶学性质中，以游离酶作为参照，固定化酶的最适PH值为9.0，较游离酶升高了1个单位，固定化酶最适温度是35 °C，较游离酶升高了5 °C。在酶稳定性中，以游离酶作为参照，固定化酶在4 °C、45 °C和50 °C条件下储存的稳定性均优于游离酶，且固定化酶在pH=8.5环境下保存24 h仍能留有初始活性的85%以上。同时固定化酶有着较为理想的批次稳定性。

关键词：金属螯合载体 腺苷酸环化酶 定向固定化 纯化

Purification and immobilization of adenylate cyclase

Abstract

In this paper, we mainly study the application of immobilized adenylate cyclase in the preparation of cAMP. The research contents mainly include the optimization of immobilized process conditions, the immobilized enzymatic properties and the stability of immobilized enzyme.

In the process, the enzyme ratio (mL • g-1) = 1, The proportion of Ni2 and carrier of 5.0×10^-2 mol/g, the immobilization time was 4 h, the immobilized pH was 8.0 and the immobilization temperature was 25°C. The immobilization method was one step of purification and fixation, and the activity of unit vector was 235 U•g-1. In the enzymatic properties,with the free enzyme as a reference, the optimum pH value of immobilized enzyme was 9.0, which was 1 unit higher than that of free enzyme. The optimum temperature of immobilized enzyme was 35 °C, which was 5°C higher than that of free enzyme. In the stability of the enzyme, the stability of the immobilized enzyme was better than that of the free enzyme at 4 °C, 45 °C and 50 °C, and the immobilized enzyme was kept at pH = 8.5 for 24 h,which can hold more than 85% of the initial activity.At the same time,the immobilized enzyme has a better batch stability.

Key words: metal chelating carriers ; adenylate cyclase; oriented immobilization；purification

目 录

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

目录 Ⅲ

第一章 文献综述 1

1.1 环磷酸腺苷的概述及应用前景 1

1.1.1 环磷酸腺苷（cAMP）简介 1

1.1.2 环磷酸腺苷的功效与应用 2

1.1.3 cAMP在国内外需求 2

1.2 国内外制备cAMP的进展 2

1.3 酶的固定化技术 3

1.3.1 腺苷酸环化酶简介 3

1.3.2 固定化酶法的优势 3

1.3.3 固定化方法需要考虑事项 4

1.3.4 传统固定化法 4

1.3.5 新型固定化方法的原理与优势。 5

1.3.6 课题的具体研究内容 5

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株 7

2.1.2 载体材料 7

2.1.3 实验所用药品 7

2.1.4 实验仪器 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 蛋白定量测定法 8

2.2.2 Ni² 浓度的测定。 10

2.2.3 酶活的测定 10

第三章 实验内容 12

3.1 载体制备 12

3.2 酶的固定化 12

3.3 固定化工艺条件优化 12

3.3.1 重组腺苷酸环化酶的纯化效果 12

3.3.2 Ni² 浓度对固定化过程的影响 12

3.3.3 温度对固定化过程的影响 12

3.3.4 pH在固定化过程的影响 13

3.3.5 时间对固定过程的影响 13

3.3.6 给酶量对固定化过程的影响 13

3.4 酶学性质的研究 13

3.4.1 反应温度对酶活性的影响 13

3.4.2 pH对酶活性的影响 13

3.5 酶稳定性的研究 14

3.5.1 较高温度下的稳定性 14

3.5.2 pH=8.5时的稳定性 14

3.5.3 常温储存稳定性 14

3.5.4 低温储存稳定性 14

3.5.5 批次稳定性 14

第四章 结果与讨论 15

4.1 固定化工艺条件优化结果 15

4.1.1 载体的选择 15

4.1.2 重组腺苷酸环化酶的纯化 16

4.1.3 Ni² 浓度对固定化过程的影响 17

4.1.4 温度对固定化过程的影响 18

4.1.5 pH对固定化过程的影响 19

4.1.6 时间对固定化过程的影响 20

4.1.7 给酶量对固定过程的影响 21

4.2 酶学性质的研究 22

4.2.1 反应温度对酶活的影响 22

4.2.2 pH对酶活的影响 22

4.3 酶稳定性研究 23

4.3.1 较高温度下酶的稳定性 23

4.3.2 pH=8.5时酶的稳定性 24

4.3.3 室温储存稳定性 24

4.3.4 低温储存稳定性 25

4.3.5 批次稳定性 26

4.4 讨论 27

参考文献 28

致谢 30

第一章 文献综述

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