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摘 要

黄酮类药物是天然药物的一个重要亚类，已发现其具有抗肿瘤、免疫调节及抗衰老等重要价值，在保健和医疗领域已经广泛应用。国内外对黄酮类化合物进行分子修饰主要是通过糖基化提高其水溶性，但其多羟基、立体结构复杂等特点制约了传统化学催化手段，生物催化剂在一定程度上弥补了这一缺陷。在前期研究中，我们筛得一株可以催化山奈酚(Kaempferol)糖基化反应的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis），从NCBI数据库中调取了其唯一的糖基转移酶基因序列，通过克隆表达及纯化大量制得该酶。在底物谱探索中我们发现该酶具有催化大豆苷元(Daidzein)、芹菜甙元(Apigenin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、染料木素(Genistein)、白藜芦醇(Resveratrol)、7-羟基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin)糖基化反应的活性。通过酶学性质研究优化反应体系，将其反应产物得率分别提高至99%、99%、97%、89%、95%、98%、99%、70%，为工业化生产及药物应用提供参考。

关键词：黄酮 糖基化 生物催化 糖基转移酶

Study on the Glycosylation of Flavonoids

Abstract

Flavonoids is an important sub class of natural drugs, it has the value of anti-tumor, anti-aging and immune regulation, and has been widely used in the health and medical fields. The flavonoids is mainly modified through glycosylation to enhance its water solubility, but its characteristics such as polyhydroxy and complex three-dimensional structure restricts the traditional chemical catalytic method. So the biological catalyst compensate for this defect to some extent.

In previous study, we have screened a Bacillus subtilis which can glycosylated 7-Hydroxycoumarin and obtained its unique glycosyltransferase gene sequence from the NCBI database, then we gain mass glycosyltransferase through clone and purification.

Through substrate spectrum we find the enzyme can glycosylated kaempferol, daidzein, apigenin, Quercetin, Luteolin, Genistein, Resveratrol and 7-Hydroxy-4-methylcoumarin. We optimized the reaction system through enzyme nature analysis and increased the yield to 99%, 99%, 97%, 89%, 95%, 98%, 99%, 70%, which laid a foundation for the industrial production and application of drugs.

Key Words: Flavonoids; Glycosylation; Biocatalysis; Glycosyltransferase

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 黄酮类化合物概况 1

1.2 黄酮类药物主要用途 2

1.3 黄酮类药物糖基化修饰及其生物转化法 4

1.4 糖基转移酶简介 4

1.5 本实验的主要研究内容及其意义 6

第二章 糖基转移酶的发掘及纯酶制备 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验试剂 7

2.1.2 主要仪器设备 8

2.1.3 菌种及质粒 8

2.1.4 培养基 9

2.2 糖基转移酶的发掘 9

2.3 工程菌的构建及目的蛋白表达 9

2.4 目的蛋白BS-GT的纯化 10

第三章 BS-GT的酶学性质研究及糖基化应用 12

3.1 实验材料 12

3.2 黄酮类产物的检测方法 13

3.3 酶学性质的表征 14

3.3.1酶相对活力测定方法 14

3.3.2最适pH及其pH稳定性 14

3.3.3最适温度及其热稳定性 15

3.3.4有机溶剂耐受性及对有机溶剂催化效率的影响 16

3.3.5酶学性质表征的分析与讨论 17

3.4 BS-GT的黄酮类底物受体谱探索 18

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1 黄酮类化合物概况

黄酮类化合物是小分子次级代谢产物（图1），与初级代谢产物不同，这类物质并非植物的存活所必需。尽管如此，超过9000个具有生物活性的结构变体已经被报道^[2]。黄酮类化合物的化学多样性、大小、三维形状、物理和生物化学性质允许它们与不同亚细胞位置的靶点相互作用，以调节植物，动物和微生物的代谢活动^[3,4]。

图1 黄酮类化合物代谢途径^[1]

黄酮类化合物在植物生理学的许多方面都有作用，最重要的作用之一就是调节生长素（植物激素）的运输^[4]。其他作用包括免疫^[5]、种间抑制^[6]和调节自由基（ROS）水平^[3,6]。黄酮类化合物也提供花色素来吸引传粉者^[7]，在许多物种中都是花粉具有活力所必需的^[8,9,10]。与其余植物物种有所差别，缺乏黄酮类化合物的拟南芥突变体的花粉并没有失去活性^[11]，这个作用可能会由其他分子相补偿。由于黄酮吸收紫外光，黄酮缺乏突变体对紫外线照射敏感，但有些可以通过过量产芥子酸酯来补偿^[12,13]。

黄酮类是抗自由基的强大抗氧化剂，因此它们被称作为“自由基清除剂”，这一活动归功于其供氢能力。实际上，黄酮类的酚类作为易于获得的“H”原子的来源，使得产生的后续自由基可以在黄酮类结构上离域^[14,15]。柑橘黄酮类能够抑制细胞信号转导和活化所必需的激酶和磷酸二酯酶，它们还影响参与免疫应答的许多细胞的激活，包括T和B淋巴细胞^[16]，这使得黄酮类具有抗感染的能力。Szent-Gyorgyi^[17]第一个考虑到黄素对毛细血管脆性和出血的影响，从而降低了老年人患冠心病的风险。黄酮类化合物具有抗动脉粥样硬化活性，在其发病机制的许多步骤中抑制动脉粥样化的形成^[18]。膳食黄酮类被认为是化学预防或抗癌剂^[18,19,20]，一些研究还显示出黄酮类抗菌活性^[21]和抗病毒活性的重要结构-活性关系^[22]。研究表明其抗病毒活性似乎与非糖苷化合物相关，而3-位羟基化显然是抗病毒活性的先决条件。

1.2 黄酮类药物主要用途

山奈酚是从水果和蔬菜中发现的多酚抗氧化剂。许多研究表明了山奈酚对降低慢性疾病特别是癌症风险的有益作用，流行病学研究显示山奈酚摄入量与癌症呈反比关系。山奈酚可能有助于增强人体对自由基的抗氧化防御以抑制癌症的发展。据报道，在分子水平上，山奈酚参与凋亡、血管生成、炎症和转移相关的细胞信号转导途径中的许多关键因子的调节。一方面，山奈酚有着显著的抑癌作用，影响血管生长并诱导癌细胞凋亡，另一方面，山奈酚在正常细胞中展现出保持细胞活力的作用，并在某些情况下发挥保护作用。

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