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摘 要

自从2013年第一次出现H7N9禽流感的新闻以来，禽流感给我国的养殖业还有民众的身体健康带来巨大的挑战。本课题旨在通过全基因PCR扩增的方法合成H7N9相关基因序列，并对其进行连接、转化、筛选和抽提出足够的量去供相关人员研究，从而来加快研究进程从而防止疾病蔓延。

方法：1.全基因合成法

2.蓝白斑筛选法

3.Triton X-114法去除内毒素

结果：本文在合成H7N9的过程中探索了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法，并通过使用Triton X-114取得低内毒素含量的H7N9基因。

关键词：全基因合成 H7N9 禽流感 PCR 蓝白斑筛选 无内毒素

Extraction Method low endotoxin plasmid

Abstract

Objective For the first time since July 2013 H7N9 of bird flu news since the aquaculture industry in our country, and bird flu in people's health is a big challenge. This topic to gene by PCR amplification of synthesis h7n9 related gene sequence,and a sufficient amount of smoking to research participants, it is accelerated by the spread of disease prevention research process.

Methods 1 total gene synthesis method

2 blue-white selection method

3 Triton X-114 Removal of endotoxin

Results In this paper, the I in synthetic process of H7N9, I will try my best to study, good reproducibility, low error rate, low cost and simple preparation method and genetic engineering.And use Triton X-114 removal endotoxin

Key words: Gene synthesis ;H7N9;AI ;PCR; Endo-Free

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 1

第一章 文献综述 3

前言 3

1.1 概述 3

第二章 材料与方法 8

2.1实验器材与试剂 8

2.1.1实验器材 8

2.1.2 实验试剂 8

2.2实验方法 9

2.2.1PCR反应的五要素 9

2.2.2引物的设计与分段 11

2.2.3 PCR反应体系及扩增 13

2.2.4 目的基因与载体的连接及转化 15

2.2.5 阳性单克隆筛选 16

2.2.6质粒的抽提 18

2.2.7内毒素的去除 18

2.2.8内毒素含量的测定 19

第三章 结果与分析 20

3.1引物分段并进行PCR扩增的结果 20

3.1.1第一轮PCR产物检测图 20

3.1.2 合并片段回收图 20

3.1.3PCR结果分析 21

3.2 目的基因与载体的连接及转化结果分析 21

3.3阳性单克隆筛选结果分析 22

3.4 纯化质粒DNA的内毒素含量检测 23

第四章 讨论 24

4.1 PCR扩增 24

4. 2目的基因与载体的连接及转化 24

4. 3阳性单克隆筛选 24

4.4 Triton X- 114去除内毒素 24

参考文献 26

致谢 29

第一章 文献综述

前言

H7N9禽流感是甲型流感的一种亚型。人感染H7N9禽流感是指由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。

流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三种。甲型流感病毒的是根据其覆盖表面的两种有抗原特性的不同纤突决定的，一种是红细胞凝集素(HA)，另一种则为神经氨酸酶(NA)。已经发现甲型流感病毒共有17种HA亚型和9种NA亚型，都能够从野生水禽中分离得到。

禽流感病毒属于甲型流感病毒，由于主要是以禽类为宿主并感染禽类，所以称为禽流感病毒。当病毒在复制过程中会随机的发生基因重配，导致结构发生改变，从而变得能够感染人类，于是造成人感染禽流感疾病的发生。

研发疫苗的基础通常是识别和构建部分病毒基因序列，该基因可表达抗原，激起机体必要的免疫反应，从而对抗活性病毒。基因合成是疫苗研发的一个强有力的工具，它能快速构建出可表达抗原的任意载体，从而诱导免疫应答抵制感染。

本文旨在用基因合成法合成H7N9相关基因序列，并以此基因为例研究使用Triton X-114获得去除内毒素的质粒的方法。通过获取的相关基因序列帮助NIH(美国国立卫生研究院)、CDC（疾病控制中心）、中科院以及香港、日本等多家知名科研机构加快对H7N9的研究，在这场对抗病毒的战斗中做出了应有的努力。

1.1 概述

禽流感（avianhifluenza，Al）由粘病毒，A型流感病毒引起的禽类传染病，可感染鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、家禽和野生鸟类、水禽、鸟类、人类和非人类的动物也能导致严重的疾病。由于禽流感病毒亚型，应变变化大，给疾病的预防和治疗带来了很大的困难。这种疾病是国际兽医局（OIE）作为一类传染病。中国也将其列为一种动物疾病。该病在意大利首次发生1878次，被称为“禽瘟”。1901年cenianni和saranuzzi分离和描述该病的病原菌，被认为是造成“过滤”。1955、谢弗证明病属于一种流感病毒（InfluenzaAvirus）。在未来几年里，美国在欧洲和美国已经从流感病毒中分离出来。从那时起，禽流感开始了人类历史悠久的历史。

AI能引起大多数家禽感染，野生鸟类和水禽，其中感觉最容易与鸡、火鸡、水禽是没有疾病的流感病毒的自然宿主和病毒感染。不同程度的感染可以发生在哺乳动物。根据在病毒表面糖蛋白HA和NA可以分为16个HA亚型和9个NA亚型的抗原性差异，不同亚型病毒之间可以通过一定的基因片段和基因重排的交流，似乎都有新的病毒的生物学特性。因此，禽流感病毒（禽流感病毒、禽流感病毒）最显著的生物学特性是众多亚型；此外，由于外部选择和免疫压力的存在，病毒的表面糖蛋白的高频率变化，导致频繁的抗原变异，因此流感活动控制了巨大的困难和挑战。

禽流感病毒属家族属。禽流感病毒粒子呈多形性，其中80 ~ 120nm球形直径、胶囊。分段单链核酸的基因组。根据外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）不同的抗原蛋白可分为16个H亚型（H1 ~ H16）和9个N亚型（N1～N9）。禽流感病毒在家禽中的感染，也能感染人、猪、马、猪和海洋哺乳动物。禽流感病毒可以感染H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、的H7N9禽流感病毒的报告。病毒是一种新的重分布型病毒，其内部基因来自H9N2亚型禽流感病毒。

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