论文总字数：23572字

摘 要

抗体是生物机体内防御系统的重要分子，然而常规抗体分子量很大，比较难穿透血管屏障到达靶点部位，不能实现预期杀伤靶细胞的目的。利用现代分子生物学的手段可将单克隆抗体（monoclonal antibody）改造成分子量小、结合力高、抗原性低的Fab（fragment with antigen binding）抗体。本文通过对X抗原免疫后的小鼠杂交瘤细胞进行单克隆测序（mAb sequencing），利用分子生物学软件SeqMan及Vector Nti分析序列并根据pTGE5表达载体的多克隆位点设计合理的PCR引物。PCR扩增抗体重链（VH CH1）和轻链（VL CL）基因片段，同时利用Over lap pcr技术拼接成Fab片段，酶切处理载体及片段，利用基因重组技术构建Fab表达载体Anti-X Fab。由大肠杆菌对重组的Fab进行原核表达，对Anti-X Fab表达载体的重组子进行酶切验证和测序验证。结果表明Anti-X Fab表达载体构建成功，为基因工程抗体后续的开发奠定了技术基础。

关键词：抗体 单克隆测序 基因重组

Construction of Anti-X Fab expression vector

Abstract

Antibody molecule is an important host defense system, but the larger molecular weight conventional antibodies are difficult to penetrate the vascular barrier to reach the target site, often can not achieve the intended purpose of killing target cells. Means of modern molecular biology may be a monoclonal antibody (monoclonal antibody) transformed into low molecular weight, high-binding, low antigenicity of the Fab (fragment with antigen binding) antibodies. Based on the mouse hybridoma cells after X antigen monoclonal sequencing (mAb sequencing), using molecular biology and Vector Nti software SeqMan sequence analysis and PCR primers designed according to pTGE5 expression vector cloning site. PCR amplification of the antibody heavy chain (VH CH1) fragment and the light chain (VL CL) gene and spliced into Fab fragments and fragments digested vector processing, the use of recombinant DNA technology to build Fab expression vector Anti-X Fab. By the E.coli Fab recombinant prokaryotic expression of Anti-X Fab recombinant expression vector by digestion and sequencing verification. The results show that Anti-X Fab expression vector achieve soluble expression in E.coli successfully constructed Anti-X Fab expression vector, the technical basis for the development of genetically engineered antibodies.

Keywords: antibody;monoclonal antibody sequencing;genetic recombination

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 选题背景 1

1.1.1 重组抗体 1

1.1.2 Fab抗体 1

1.2 研究思路 2

第二章 实验设计与流程 3

2.1 材料与仪器 3

2.1.1 试剂 3

2.1.2 仪器 3

2.2 杂交瘤细胞总RNA的抽提 3

2.2.1 TRziol法抽提总RNA原理 3

2.2.2 抽提流程 4

2.3 RT-PCR 4

2.3.1 反转录原理 4

2.3.2 反转录体系 4

2.4 单克隆测序 5

2.4.1单克隆测序原理 5

2.4.2 测序结果分析 5

2.5 表达载体的选择 7

2.5.1 表达载体的选择 7

2.5.2 pTGE5载体图谱 8

2.6 Fab的设计 8

2.6.1 Linker的选择 8

2.6.2 Fab的拼接顺序 9

2.6.3 设计的Fab序列 9

2.7 PCR引物的设计 10

2.7.1 设计原理与原则 10

2.7.2 PCR引物序列 10

2.8 重链和轻链基因的扩增 11

2.8.1 PCR扩增重链和轻链基因 11

2.8.2 PCR产物的纯化 12

2.9 重链及轻链基因TA克隆及测序分析 12

2.9.1 片段3’加A尾 12

2.9.2 TA克隆 13

2.9.3 蓝白斑筛选 14

2.9.4 测序分析 14

2.10 Over lap PCR拼接Fab 14

2.10.1 Over lap PCR原理 14

2.10.2 Over lap PCR拼接Fab基因片段 15

2.11构建Anti-X-Fab-pTGE5表达载体 16

2.11.1 Fab片段和pTGE5载体的酶切 16

2.11.2 克隆转化 16

2.11.3 菌落筛选和酶切验证 17

第三章 结果与讨论 17

3.1 Totol RNA的提取 18

3.2克隆Anti-X单克隆抗体重链、轻链基因 18

3.2.1 重链和轻链基因的扩增和纯化 18

3.2.2 重链、轻链基因TA克隆及菌落筛选，测序 19

3.3 Over lap PCR拼接Fab基因片段 20

3.4 Anti-X-Fab-pTGE5表达载体的构建 20

3.4.1 克隆转化及阳性克隆筛选 20

3.4.2 酶切、测序验证 21

第四章 结论与展望 23

参考文献 24

致谢 26

第一章 绪论

1.1 选题背景

1.1.1 重组抗体

抗体（antibody）是指生物机体在特定的抗原刺激下，由免疫系统的B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞所产生的、可与特定抗原产生特异性结合的免疫球蛋白（Ig）。抗体分子的结构大部分都很相似，都由两条重链（heavy chain）和两条轻链（light chain）组成，形成对称结构。抗体重链和轻链可分为可变区和恒定区，在重链中可变区约占1/4,而轻链较短，可变区约占1/2 ^[1]。抗体与抗原相互结合的部位位于重链和轻链的可变区部分，可变区由110个左右氨基酸组成，其中有三个区域氨基酸残基变化较大称之为互，决定区（comple-mentarity-determining region,CDR），四个区域氨基酸组成与序列变化较少，同时加持着三个CDR区，称它们为框架区（framework region，FR) ^[2]。一般认为可变区决定着抗体的主要功能，是抗体最主要组成部分^[3]。

随着现代分子生物学技术的发展，1975年杂交瘤技术问世，利用小鼠杂交瘤富集培养，可获得单克隆抗体，即单抗。利用这种成熟的技术可制备大量且高特异性的抗体^[4]。单克隆抗体技术的成熟为重组抗体的开发创造了有利条件。利用单克隆抗体和基因重组技术，通过对抗体基因的改造，改善其分子量、分子结构及其免疫原性，从而构建出多种重组抗体^[5]。重组抗体技术的成熟为抗肿瘤药物的开发开辟了新的道路。截至2016年03月15日，CFDA受理抗体药物达到280多个，国产品种就达到148个之多，足以可见抗体药物的开发前景之广阔^[6]。

1.1.2 Fab抗体

Fab抗体由完整的轻链（VL CL）和重链的可变区加恒定区1（VH CH1）组成，其大小约为完整抗体的1/3，分子量约为55 KD。Fab抗体在结构上由于不含有铰链区，有着很小的分子量，同时免疫原性较低、结合能力强，顾在治疗肿瘤方面有着其独特的优越性^[7]。在基因工程抗体中，Fab类(Fabs)抗体成为了今年来的热门研究方向。原核和真核表达载体系统等皆用于制备Fab抗体，运用大肠杆菌表达抗体的技术已经相当成熟，在用于制备Fab类抗体药物的研究中无可取代^[8]。目前已有抗CD3单抗等16种Fab类抗体药物申请通过了美国FDA并成功上市，目前已有多种Fab类抗体药物处于临床试验阶段。

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