论文总字数：15126字

摘 要

本文主要介绍了通过化学方法Fmoc-固相多肽合成制备多肽药物胰高血糖素的工艺流程。通过固相载体树脂与目标肽的第一个氨基酸的羟基以共价键形式相连，从C端到N端按肽链顺序添加、缩合氨基酸的合成过程。合成过程通过缩合试剂将前一个脱去氨基保护基的氨基酸与过量活化的第二个氨基酸结合，利用指示剂茚三酮来检测每一步反应是否完全，直至达到所要肽链长度，通过强酸裂解得到粗肽。最后用高效液相色谱法分析制备多肽，通过液相色谱-质谱（LC-MS）来鉴定产品多肽的分子量，提高多肽纯度和活性。

关键词：胰高血糖素 固相合成 纯化 HPLC

Glucagon peptide drug development process

Abstract

This paper describes the process for preparing the glucagon peptide drugs by chemical methods "Fmoc- solid phase peptide synthesis." By the first amino acid to a solid support resin and hydroxyl target peptide covalently linked form, end N-terminal peptide sequence from C by adding condensation synthesis of amino acids. Synthesis by condensing a reagent before removal of the amino protecting group of the amino acid activated with an excess of the second amino acid binding using ninhydrin indicator to detect whether the complete reaction of each step, until the desired peptide chain length, by strong acid cleavage to give The crude peptide. Finally, high performance liquid chromatography analysis and preparation of peptides by liquid chromatography - mass spectrometry (LC-MS) to identify the molecular weight of the polypeptide product, improve the purity and activity of the polypeptide.

Key Words: Glucagon; solid phase synthesis; purification; HPLC

目录

摘 要 I

Abstract I

第一章 引言 1

1.1 胰高血糖素 1

1.1.1 胰高血糖素的作用 1

1.1.2 胰高血糖素的一级结构 2

1.2 多肽概述 2

1.3 多肽固相合成的原理 3

1.4 多肽固相合成中使用到的方法 4

1.4.1 固相合成 4

1.4.2酰胺键缩合 5

1.5 课题来源及思路 6

1.6 胰高血糖素工艺开发的目标和意义 7

第二章 胰高血糖素的合成工艺 8

2.1 实验仪器和设备、试剂 8

2.2 合成过程的检测 9

2.3 树脂的选择及改造 9

2.4 氨基酸的缩合 10

2.5 合成步骤 12

2.6 裂解及侧链保护基脱除 13

第三章 胰高血糖素的纯化 15

3.1 高效液相色谱分离原理 15

3.1 仪器设备、试剂 15

3.2 色谱条件 15

3.3 胰高血糖素的粗品分析 16

3.6 胰高血糖素的粗品纯化 17

3.7 冻干 20

3.8 纯品分析 20

第四章 结论与讨论 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 引言

1.1 胰高血糖素

1.1.1 胰高血糖素的作用

胰高血糖素又称高血糖素、升血糖素，是由胰岛α细胞所分泌的一种直链多肽激素，包含29个氨基酸，相对分子质量为3482.72。胰高血糖素具有促进肝糖原分解、肝糖原异生、脂肪分解及酮体生成四大生理作用。

胰高血糖素的主要作用是促糖原分解和产生葡萄糖使血糖升高;其次还可以通过腺苷酸环化酶而使环磷酸腺苷(cAMP)水平增高，从而激活蛋白激酶，活化脂肪组织中的脂肪酶，促使脂肪分解;激活心肌腺苷酸环化酶系统，促进心肌磷酸化酶的活性，增加钙在心肌中的积聚，从而增强心肌收缩力，增加心脏输出量和提高血压;还能促进胰岛素、生长抑素、甲状腺素和降钙素的分泌;促进交感神经和嗜铬细胞释放儿茶酚胺。胰高血糖素与胰岛素、生长抑素相互调节，使血糖维持于正常范围^[1]。

胰高血糖素是由胰岛α2 细胞合成并分泌的一种单链多肽类激素。为胰岛素的生理性拮抗剂。对代谢的影响与肾上腺素相似，有以下作用：

1、升高血糖作用：能激活肝脏的磷酸化酶，促进肝糖原分解和糖原的异生，升高血糖。

2、正性肌力作用：能提高细胞内cAMP含量，增强心肌收缩性，增加心输出量及每搏作功量。其正性肌力作用在应用足量强心甙后仍能发挥，且不被普萘洛尔所阻断。虽可增加心率及升高血压，但不致引发心律失常。其产生机制为：①激活腺苷酸环化酶使三磷酸腺苷转变成环化单磷酸腺苷，使心肌收缩力增强;②促进肝糖原分解，提高血糖水平;③促进胰岛素释放，改善心肌对葡萄糖的利用，并促进心肌的无氧酵解，从而改善心肌的能量代谢。与洋地黄类强心苷合用，可增加疗效。

3、对肾脏的作用：扩张肾血管，改善肾血流，促进钠、钾、钙的排泄。

4、对消化系统的作用：可引起胃及十二指肠、小肠及结肠的平滑肌松弛，抑制胃、小肠及结肠的蠕动，增加胆汁和肠液的分泌。

5、对分泌系统的作用：兴奋肾上腺髓质，促进儿茶酚胺类物质的释放。亦可促进胰岛素、甲状腺激素、降钙素及生长激素的分泌。

1.1.2 胰高血糖素的一级结构

胰高血糖素的一级结构是：

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr- Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH。

图1-1 胰高血糖素的一级结构

1.2 多肽概述

1963年Merrifield提出固相多肽合成方法，为多肽研究推向了更广阔的天地，极大的推动分子生物学等领域的发展，为此1984年Merrifield获得诺贝尔文学奖^[2]。

请支付后下载全文，论文总字数：15126字