论文总字数：21778字

摘 要

木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源，有很多的产纤维素酶的菌株被筛选得到，但多数菌株只能生产单一功能的纤维素酶，天然的木质纤维素很难被降解。因此筛选得到多功能的纤维素酶是很有研究价值的。本论文对来源于B. subtilis Lucky9的内切葡聚糖-木聚糖双功能酶的异源表达进行了初步研究，对表达后的酶进行纯化，以及酶学性质的研究。主要研究结果如下：

1. 成功克隆出了B. subtilis Lucky9来源的，双功能酶基因EX1，全长1881bp，编码627个氨基酸。
2. 成功构建表达载体pET-EX1，并在E.coli BL21(DE3)中，实现可溶性表达，采用SDS-PAGE验证，表明在该酶在65 kDa左右。
3. 研究双功能酶EX1的酶学性质，结果显示其最适反应温度为55℃，最适反应pH为 6.5，木聚糖酶活性相对于内切葡聚糖酶活性具有更好的热稳定性。
4. 双功能酶EX1对金属离子没有依赖性，Fe³ 和Zn² 离子对该酶有一定的抑制作用；Ca² ，Ni² 和Co² 对该酶有一定的促进作用。

关键词：双功能纤维素酶EX1 克隆表达 纯化 酶学性质

Expression of endoglucanase - xylan bifunctional cellulase in Escherichia coli

Abstract

Lignocellulose is the world's most plentiful and inexpensive renewable resources.At present, a lot of cellulase was screened, but the majority of strains only produce single functional cellulase. So it is difficult to degrade the natural lignocellulose totally. Therefore, it is necessary to screen the multifunctional cellulase.An efficient B.subtilis strain Lucky9 secreting endoglucanse-xylan bifunctional cellulase was isolated by our laboratory.This thesis contain three main pieces of work:(1) Cloning and expression of the bifunctional cellulase EX1 in E. coli BL21(DE3);(2) Purification of the expressed bifunctional cellulase EX1; (3) Characterizations of the purified bifunctional cellulase EX1;

The main results are as follows:(1) The gene encoding bifunctional cellulase EX1 was cloned from B. subtilis Lucky9 genome. The genome encodes 627 amino acids which full length is 1881bp.(2) The recombinant plasmid pET-EX1 was consturcted and then transformed into E. coli BL21(DE3). The apparent molecular weight of the recombinant enzyme was 65 kDa detected by SDS-PAGE.(3) The enzymatic properties of the bifunctional enzyme EX1 were studied. The results showed that the optimum reaction temperature was 55℃, and the optimum reaction pH was 6.5.The thermal stability of xylanase enzyme activity is better than endoglucanase enzyme activity.(4) Bifunctional cellulase EX1 is not a metal dependent enzyme, Fe³ and Zn² ions can inhibit the enzyme activity; Ca² , Ni² and Co² have a certain role in promoting the enzyme.

Key Words:Bifunctional cellulase EX1;Cloning and expression;Purification;Characterization

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1概述 1

1.2内切葡聚糖酶的研究概况 1

1.3产纤维素酶的枯草芽孢杆菌研究进展 2

1.4内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中表达的研究进展 2

1.5 内切葡聚糖酶的应用 3

1.6木聚糖酶的研究概况 3

1.6.1木聚糖的概述 3

1.6.2木聚糖酶的性质 3

1.6.3木聚糖酶的工业应用 3

1.7本课题的研究意义和目的 4

第二章 内切葡聚糖-木聚糖双功能纤维素酶的克隆表达 5

2.1实验仪器 5

2.1.1菌株与质粒 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3实验仪器 6

2.1.4培养基 7

2.1.5电泳相关溶液的配制 7

2.2 实验方法 7

2.2.1 基因组提取 7

2.2.2目的基因的扩增 8

2.2.3目的基因与载体的连接 9

2.2.4大肠杆菌感受态的制备及转化感受态 9

2.2.5菌落PCR鉴定阳性克隆与测序 10

2.2.6表达载体的构建 10

2.2.7重组菌在大肠杆菌中的表达 11

2.2.8 双功能酶EX1的分离纯化 13

2.2.9 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳，操作步骤如下： 13

2.3 结果与讨论 14

2.3.1双功能酶基因的扩增 14

2.3.2双功能酶基因表达载体的构建 14

2.3.3双功能酶EX1的纯化 14

2.4 本章小结 15

第三章 B. subtilis Lucky9中葡聚糖酶pET-EX1的性质研究 16

3.1 实验试剂与仪器 16

3.1.1 实验试剂 16

3.1.2 实验仪器 16

3.2 实验方法 17

3.2.1 反应温度对双功能酶 EX1活力的影响 17

3.2.2 反应pH对双功能酶 EX1活力的影响 17

3.2.3 双功能酶 EX1的温度稳定性 17

3.2.4 双功能酶EX1的pH稳定性 17

3.2.5 金属离子对双功能酶 EX1的影响 17

3.2.6 双功能酶 EX1的底物特异性 17

3.3 结果与讨论 18

3.3.1 反应温度对双功能酶EX1活力的影响 18

3.3.2 反应pH对双功能酶EX1活力的影响 18

3.3.3 双功能酶EX1的温度稳定性 19

3.3.4 双功能酶 EX1的pH稳定性 20

3.3.5 金属离子对双功能酶 EX1的影响 20

3.3.6 双功能酶 EX1的底物特异性 21

3.4 本章小结 21

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

致 谢 26

第一章 文献综述

1.1概述

木质纤维素是植物细胞壁的主要成分，是世界上最丰富的可再生资源。木质纤维素主要由木质素、纤维素、半纤维素组成。观察植物细胞壁的构造，发现木质素在最外层，而里面的是半纤维素和纤维素，木质素的较难降解性增加了降解木质纤维素的难度。因此想要利用以木质纤维素为底物实现能源的转换目前仍是相当困难的。但随着世界人口的增长，能源危机的出现，开发、筛选新的纤维素酶以及生物转化木质纤维素的技术显得尤为的重要。

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