论文总字数：19005字

摘 要

L-苹果酸是生物体内代谢过程中的重要有机酸，具有很多生物功能，尤其在能量代谢方面起着重要的作用。目前苹果酸的生产分为有氧发酵和厌氧发酵,相对于厌氧发酵，有氧发酵相更利于菌体的生长，产能高，但是在有氧发酵生产当中,代谢途径都是由糖酵解途径结合三羧酸循环（氧化或还原）或者乙醛酸循环途径两个模块组成，而糖质在经过糖酵解途径里的丙酮酸到乙酰辅酶A的转化过程中会有一分子的CO₂损失，造成了碳流失，一定程度上增加“温室效应”，违背了绿色生物的宗旨。

最新研究发现的在双歧杆菌中存在一个与糖酵解（EMP）途径并行的非氧化糖酵解途径（NOG）路径，该途径解决了EMP途径中碳流失的问题。所以本文首先以E.coli W1485为出发菌株，敲除了编码苹果酸脱氢酶基因mdh，构建有氧条件下积累苹果酸的大肠杆菌生产菌株，随后串联表达了磷酸转酮酶和果糖1，6-二磷酸酶。实验发现，葡萄糖初始浓度为20g/L时，单独表达磷酸转酮酶，苹果酸的产量为7.6g/L，收率为0.38g/g；而共同表达磷酸转酮酶和果糖1，6-二磷酸酶时，苹果酸的产量达8.7g/L，收率达0.435g/g。果糖1，6-二磷酸酶的表达使非氧化糖酵解途径增强了14.5%。为今后我们在研究有氧发酵生产产量提高方面提供了一个新的思路。

关键词：苹果酸；糖酵解；非氧化糖酵解途径；果糖1，6-二磷酸酶

Research on the use of non-oxidative glycolytic pathway to improve the efficiency of carbon

Abstract

L- malic acid is important organic acids in vivo metabolism with many biological function. In particular, it plays an important role in energy metabolism. Malic acid production is currently divided into aerobic fermentation and anaerobic fermentation .Compared with anaerobic fermentation , aerobic fermentation is more conducive to the bacterial growth and it can produce more energy. However, in aerobic fermentation production biosynthetic pathways of L-malic acid are combined with two modules: a glycolytic pathway citric acid cycle (oxidation or reduction) or glyoxysomes way, while carbohydrate will lose a molecule of carbon in the glycolytic transformation process from pyruvate to acetyl coenzyme A, resulting in a loss of carbon, increase the "greenhouse effect" to a certain extent, contrary to the purpose of the green creatures.

The latest study found that there is non-oxidative glycolytic pathway (NOG) pathway parallel with the glycolysis (EMP) path in bifidobacteria and this pathway soloves the carbon loss problem in EMP. The premise of this path is to have enough fructose-6-phosphate to promote. So in this paper, as a starting, I knocked gene mdh encoding malate dehydrogenase in the E.coli W1485 strain, constructing a producing malic acid strain of E. coli under aerobic conditions followed by a series expressing transketolase phosphate and fructose 1,6 - bisphosphatase. It was found that initial glucose concentration of 20g / L when expressing phosphatase transketolase alone, malic acid yield was 7.6g / L and the yield was 0.38g / g; when the co-expression of transketolase phosphate and fructose 1, 6 bisphosphatase, malic acid production reached 8.7g / L and the yield was 0.435g / g. Expression of the enzyme fructose-1, 6-diphosphate made the non oxidative glycolytic pathway increase 14.5%.This study provides us a new way to improve aerobic fermentation production yield in future.

Keywords: Malic acid; glycolysis; non-oxidative glycolytic pathway; fructose 1, 6 bisphosphatase

目录

摘要 I

Abstract II

目录 I

第一章 前言 1

第二章 文献综述 2

2.1 L-苹果酸 2

2.1.1 苹果酸的理化性质 2

2.1.2 L-苹果酸在生物中的代谢途径 2

2.1.3 L-苹果酸的生产 3

2.1.4 L-苹果酸的用途 4

2.2苹果酸基因工程菌的构建 5

2.2.1大肠杆菌 5

2.2.2枯草芽孢杆菌 5

2.2.3酵母 5

2.3非氧化糖酵解途径 6

2.4课题来源及研究内容 7

2.4.1课题来源 7

2.4.2本课题研究内容 7

第三章 材料与方法 9

3.1菌株 9

3.2主要实验试剂 9

3.3主要实验仪器 9

3.4培养基 10

3.5目的菌株E. coli W1485Δmdh的构建 10

3.6目的质粒pTrc99a-fbp-fpk的构建 13

3.7 E. coli W1485感受态的制备与转化 15

3.8摇瓶发酵 16

第四章 结果与讨论 17

4.1目的菌株E. coli W1485Δmdh的构建 17

4.2目的质粒pTrc99a-fbp-fpk的构建 17

4.3摇瓶发酵 19

4.4讨论与展望 19

参考文献 21

致谢 24

第一章 前言

L-苹果酸是一种在植物、动物和微生物细胞中普遍分布的重要自然有机酸，它比柠檬酸酸度大但味道柔和而且不对牙齿和口腔造成破坏，它口感接近苹果的酸味，是新一代的食品酸味剂，在生理代谢上不会累积脂肪，对氨基酸吸收好，食品营养界和生物界称其为“最理想的食品酸味剂”，是被人们认为具有杰出发展远景的有机酸其一^[1]。苹果酸大多是基于石油为原料，使用化学合成法生产的，主要包括顺丁烯二酸或者反丁烯二酸通过高温高压加水催化等多种方法^[2]。但经过化学合成的是DL-苹果酸，虽然成本不高，可是不易于吸收，一般带有毒性，不能在医药和食品工业中大量应用。目前酶转化法主要以延胡索酸酶转化生产苹果酸，但是原料依靠化学合成的高纯度延胡索酸，而延胡索酸存在原料价格昂贵、产品中含有大量杂酸、产生大量污染等缺点^[3]。微生物发酵生产L-苹果酸具有食用安全性、生产成本低、原料来源丰富、杂酸含量低等特点。发酵法生产L-苹果酸摆脱了对石化原料的依靠，被誉为最有前景的方法^[4]。

微生物发酵生产苹果酸当中，主要分为有氧发酵和厌氧发酵，厌氧发酵与有氧发酵相比不利于菌体的生长，所以我们采用有氧发酵的方法^[5]。但是在有氧发酵生产当中,代谢途径都是由糖酵解途径结合三羧酸循环（氧化或还原）或者乙醛酸循环途径两个模块组成，而糖质在经过糖酵解途径里的丙酮酸到乙酰辅酶A的转化过程中会有一分子的CO2损失，造成了碳流失，一定程度上增加“温室效应”，违背了绿色生物的宗旨。在最近的研究中发现，在双歧杆菌中存在一个与糖酵解（EMP）途径并行的非氧化糖酵解途径（NOG）路径^[6]。在NOG途径中，首先糖酵解产生的一分子果糖-6-磷酸和碳重排回补的两分子果糖-6-磷酸经磷酸转酮酶分解生成三分子乙酰磷酸和三分子赤藓糖-4-磷酸，三分子的赤藓糖-4-磷酸经碳重排又生成两分子果糖-6-磷酸，回补到第一步。乙酰磷酸继而生成乙酰CoA，进入三羧酸循环，没有任何碳流失。目前有研究已将NOG途径引入到了乙酸的生产当中，乙酸的产量有了明显的提升^[7]。

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