论文总字数：21793字

摘 要

甜叶菊是一种新型的天然甜味剂，但其中的甜菊甙具有较强的后苦味。甜菊糖中具有较强后苦味的甜菊甙可以通过糖基转移酶UGT76G1的一步糖基化反应生成甜度较高的莱鲍迪甙A（Rebaudioside A），改善甜菊糖的味质。

植物来源的基因在原核表达系统中表达都会面临产生包涵体的问题，毕氏酵母真核细胞表达系统，能有效解决产酶过程中出现包涵体的现象，进而获得有效的甜叶菊糖基转移酶（UGT76G1），为催化甜菊甙生产提供酶源。

本实验将植物来源的UGT76G1基因插入到pPIC9K质粒的EcoR I和Not I酶切位点之间，构建pPIC9K-UGT重组质粒。将重组质粒导入到宿主细胞大肠杆菌DH5α细胞中，筛选出重组阳性菌进行测序验证。然后将验证成功的重组阳性菌提取质粒，将其电转入毕氏酵母GS115菌株内，利用高浓度G418硫酸盐抗性进行筛选，将筛选的阳性克隆用甲醇诱导进行摇瓶发酵。最后用薄层层析（TLC）色谱法筛选出酶活较高的菌株。

结果发现：确定最佳诱导时间为120小时，蛋白表达量达到 0.66mg/ml.通过TLC实验发现酶具有一定的催化活性，但活性不高。

关键词：糖基转移酶UGT76G1，毕赤酵母GS115，重组基因，莱鲍迪甙A

The expression and secretion of Exogenous glycosyl transferase in pichia

ABSTRACT

Stevia is an excellent natural sweeteners,But the stevioside has stronger after the bitter taste.Glycosyl transferase UGT76G1 can transfer stevia sugar has strong bitter taste of stevioside into generate high sweetness of rebaudioside A by one step sugar radical reaction.So that can improve the taste of stevioside.

Plant derived genes are mostly expressed in prokaryotic cells faced with the problem of production of inclusion body.Pichia pastoris eukaryotic expression system can effectively solve the phenomenon of the inclusion body in the process of production,so that can obtain effective sugar-based transfer enzyme (UGT76G1) in stevia rebaudiana.This expression system provide the enzyme source for the production of stevioside.

In this study, we insert the synthetic gene of UGT76G1 into the EcoRI and NotI sites of pPIC9K plasmid,construct pPIC9K-UGT recombinant plasmid. The recombinant plasmid was introduced into the host cell E. coli DH5α.Then we screen and verify the recombinant positive bacteria and validate it by Sequencing.Then ,the experiment validation of successful recombinant positive bacteria successful recombinant positive bacteria,and transfer it into the Pichia pastoris GS115 strain.Using G418 sulfate to screen the positive clone.The positive clones screened were induced by methanol to shake flask fermentation.Finally,use TLC to screen the positive strains.

Conclusion: Determine the optimal induction time is 120 hours,Expression of protein reached 0.66 U/mg.

Key words: glycosyltransferaseUGT76G1 ; Pichia pastoris GS115; recombinant gene; Rebaudioside A

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2甜菊糖的成分及性质 1

1.2.1甜菊糖的理化性质 1

1.2.2甜菊糖的组分 1

1.3糖基转移酶（UGT）的来源和性质 2

1.4毕氏酵母表达系统 3

1.4.1巴斯德毕氏酵母真核表达系统的研究概况 3

1.4.2毕氏酵母表达系统和大肠杆菌表达系统的区别 4

1.4.3体内实现重组质粒在毕赤酵母基因组中整合 4

1.5本课题研究的意义和思路 4

第二章 pPIC9K-UGT质粒构建 6

2.1前言 6

2.2材料与方法 6

2.2.1实验仪器 6

2.2.2实验试剂 7

2.2.3菌体与质粒 8

2.2.4工具酶和试剂盒 8

2.2.5培养基配制 8

2.3实验方法 8

2.3.1质粒小提实验 8

2.3.2酶切反应 9

2.3.3酶切后质粒的胶回收 10

2.3.4PCR实验 11

2.3.5PCR结果纯化 11

2.3.6连接反应 12

2.3.7大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 12

2.3.8转化实验 13

2.3.9 pPIC9K受体菌DH5a双挑 13

2.4结果与分析 14

2.5本章小结 14

第三章 重组质粒在毕赤酵母中的分泌表达及蛋白含量测定 15

3.1前言 15

3.2.1实验仪器 15

3.2.2实验试剂及培养基 16

3.3毕赤酵母电转实验 17

3.3.1质粒线性化 17

3.3.2.乙醇沉淀法浓缩线性质粒 17

3.3.3GS115 感受态制备 17

3.3.4电转 18

3.3.5目的菌株的筛选 18

3.4结果与分析 18

3.4.1Bradford法测定蛋白浓度 18

3.4.2小体系反应测酶活性（3ml） 19

3.4.3TLC法检测莱鲍迪甙A的含量 19

3.4本章小结 20

第四章 结论与展望 21

4.1主要结论 21

4.2展望 21

参考文献 22

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1前言

随着对甜味产品的消费比例不断提升，消费者对高倍甜味剂的依赖趋势越来越明显。甜菊糖是菊科，多年生草本植物，作为一种天然、高甜度、低热量的新型甜味剂开始受到消费者的欢迎，它不仅符合现在所崇尚的健康饮食的要求，而且为糖尿病、龋齿、高血压等疾病提供了良好的甜味剂替代品，并具有一定辅助疗效和药理作用，被誉为“世界第三蔗糖”^[1]。目前已知从甜菊糖（Stevioside）中能分离出八种糖苷，其中莱鲍迪甙A的甜度最高，约为蔗糖的300-400倍，但热量不足蔗糖的1/300^[3]，且味质最好，不含任何甘草余味和后苦味，是一种理想的甜味剂。而市售的甜菊糖一般以甜菊甙（简称，St甙）为主，但其具有较强后苦味，影响消费者口感。因此，如何通过提高莱鲍迪甙A（RA甙）在甜菊糖总甙中的相对含量，使甜菊糖味质更好甜度更高，成为当今甜菊糖食品生产工业研究的热门内容之一。

1.2甜菊糖的成分及性质

1.2.1甜菊糖的理化性质

甜菊糖即甜菊糖苷，是一种白色粉末状固体，具有良好的耐热性，能在95℃加热处理两小时的情况下保持甜度不变，且不易见光分解，即使在120℃下放置一小时，性质仍然十分稳定，不会变焦。当pH在3--9内，温度为100℃时，甜菊糖稳定，但在强碱条件下会迅速分解。甜菊糖的甜度很高，约为蔗糖的250-300倍^[13]。甜菊糖中含量最高的成分为甜菊苷，其次为莱鲍迪甙A。其中莱鲍迪甙A（Rebaudioside A）的甜度约为甜菊苷的1.2倍，是甜菊糖各组分中甜度最高的。莱鲍迪甙A的苷元 C-13 上多带一个葡萄糖基，稳定性和水溶性（为甜菊苷的 6~7 倍）得到了提高。

1.2.2甜菊糖的组分

经过多年的科学研究发现，从甜菊糖中能分离出八种二帖糖苷^[7]，其名称、含量、甜度见表1-2。其中甜叶菊叶片中含量最高的为甜菊糖苷，约为甜叶菊的55%，甜度最高的为莱鲍迪甙A（Rebaudioside A），占甜菊糖总含量的20%^[8]。

表1-2甜菊糖不同成分含量及甜度

1.3糖基转移酶（UGT）的来源和性质

在自然界中，糖基转移酶一般用于催化目标化合物的选择性修饰。这些酶采用一个激活的基板供体，通常是单个核苷二磷酸（NDP）糖，转移后的糖基会残留在受体分子的一个特定位置。UDP-葡萄糖基转移酶（UGTs）是糖基转移酶家族中的一个重要分支。糖基转移酶UGT76G1能将甜菊糖中具有余苦味的甜菊甙（简称，St 甙）通过一步糖基化反应生成莱鲍迪甙A（简称，RA 甙）。在催化过程（见图1-3），糖基转移酶发挥出色的区域选择性和立体化学性，因此它被公认为是具有很高价值的糖基化催化剂。由于糖基转移酶独特的结构、作用机制，决定了该酶具有高度底物特异性，从而限制了多样性糖基的转移，所以导致难以获得具有多样性结构的糖苷类化合物。在糖基转移酶UGT76G1 催化的糖基转移反应中，一般都需要以价格昂贵的UDPG作为糖基的供体，所以这必然会影响RA甙酶在促进合成应用方面的经济适用性。

请支付后下载全文，论文总字数：21793字