论文总字数：15409字

摘 要

建立了从中使用PS-DVB为基质的高聚物型色谱柱。反相高效液相色谱法对葛根提取液中的葛根素和大豆苷元进行分离并分析。采用MKF-RP-HH色谱柱（300x7.8mm, 8μm），葛根提取液经70%乙醇经过溶解稀释。以水（A）和甲醇（B）做为流动相，进行梯度洗脱。流速1.0ml/min时检测波长为250nm，柱温30℃。结果表明，葛根提取液中的2种有效成分葛根素和大豆苷元均与其中的杂质形成了较好的分离效果，柱效大于2100N/m，且优于常规的C-18硅胶色谱柱（柱效：1000N/m）。该高聚物型色谱柱有耐酸、碱，耐压、耐水、耐有机溶剂的效果，无不可逆吸附。本方法简便、准确地用于葛根素和大豆苷元的分离并分析。

关键词：聚苯乙烯-二乙烯基苯 高聚物型色谱柱 葛根素 大豆苷元

Analysis of the liquid extract puerarin

ABSTRACT

Established using the PS-DVB polymer as a matrix-type columns, reversed-phase HPLC Kudzu extract puerarin and daidzein separation analysis. Using MKF-RP-HH column (300x7.8mm, 8μm), kudzu root extract was diluted with 70% ethanol and dissolved in water (A) and methanol (B) as the mobile phase flow rate was 1.0ml / min, detection wavelength 250nm, the column temperature was 30 ℃. The results showed that kudzu root extract two types of active ingredients puerarin and daidzein were associated with impurities to achieve a better separation effect, and the column efficiency is greater than 2100N / m, better than the conventional C-18 silica gel column chromatography (column efficiency : 1000N / m). The polymer-type columns acid, alkali, pressure, water, organic solvents, all reversible adsorption. This method can be easily and accurately analyzed for the separation of puerarin and daidzein.

KEYWORDS: Polystyrene-divinyl-benzene; Polymeric chromatographic column; Pressurization; Puerarin; Daidzein;

目 录

摘 要 II

ABSTRACT III

1. 引言 1

1.1 色谱分析方法 1

1.1.1 色谱分析方法简介 1

1.1.2 色谱分析方法分类 2

1.2 色谱柱填料的简介与分类 3

1.2.1 无机基质材料 4

1.2.2 多糖基质材料 4

1.2.3 高聚物基质材料 5

1.3 葛根素及大豆苷元的分离分析 6

第2章 实验部分 8

2.1 实验部分 8

2.1.1 仪器与试剂 8

2.1.2 液相色谱检测条件 8

2.1.3 葛根素与大豆苷元的混合对照品溶液、葛根提取液的配置 8

2.2 结果与讨论 9

2.2.1 流动相中甲醇含量对葛根提取液分离效果的影响 9

第3章 结论与展望 15

3.1 结论 15

3.2 展望 15

致谢 16

文献综述 17

第1章 引言

1.1 色谱分析方法

1.1.1 色谱分析方法简介

色谱法（chromatography），也称层析法。是现代用于分离并分析时的重要方法之一。色谱法是根据被分离的混合物中的各组分在固定相、流动相之间的吸附作用和溶解度不同。或者是因为被分离组分中的分子结构、分子大小存在这差异，使各组分在色谱柱中随流动相移动的速度不同，从而达到分离的一种检测方法^[1]。

1903年茨维特（Tsweet）发表了第一篇有关“色谱法”的论文，发表于1906-1910年，他利用图1装置，成功分离出胡萝卜素、叶绿色、叶黄素，茨维特将该色素分离方法正式命名为“色谱法”，从而被认为是色谱法的创始人^[2]。但是由于该液相色谱法具有较低的分离效率，较慢的分离速度等缺点，在很长一段时间内未得到人们广泛的关注和重视。直到1931年，该色谱方法才被奥地利化学家库恩使用，并将其优化为液-固吸附色谱，从此，色谱法才得到科学界的重视^[3]。1952年，英国的马丁（Martin）和辛格（Synge）因发明了气相色谱，从而共享了诺贝尔化学奖^[4]。由于气相色谱法可实现几十种到几百种成分的分析，因此该色谱法被广泛地用于石油化工领域^[5]。随着实验技术、仪器设备等方面的完善和成熟，又出现了毛细管色谱法并也得到了快速发展，当其与高灵敏度的检测器结合，更可测得低于微克级的痕量组分^[6]。

图1 典型柱色谱装置示意图

Fig.1 The experimental facilities of the classical column chromatography

气相色谱法中工作温度一般为350~500℃^[7]，多种化合物（如强极性、高沸点、热不稳定、复杂的大分子混合物等）在该温度范围内不能达到分离分析的效果；因此，在回顾气相色谱法的发展进程中，人们重新致力于液相色谱法上面的研究。首先高压输液系统代替了重力输送流动相，以及采用了粒径小的固定相来提高柱效，直至1960s，在典型液相色谱法发展的基础上，液相色谱法逐步发展为具有分析速度快和效率高的液相色谱法，以致出现了高效液相色谱法（HPLC）^[8]。自二十世纪八十年代以来，HPLC的应用范围大大扩大也成为世界上应用最广的分析技术之一^[9]。

1.1.2 色谱分析方法分类

色谱法是有很多种类的，不同的分类标准表示有着不同的种类^[10]，见表1。

表1 色谱法的种类

Table 1 Species of chromatography

1.2 色谱柱填料的简介与分类

在色谱法中，按固相形态分可以为平板色谱和柱色谱两种。平板色谱法操作简单，工艺成本低廉，但不能对被分离物质进行定量分析、灵敏度低；柱色谱法具有分离效能高、灵敏度高、专一性强和可定量分析等优点，且既可用于微量物质的检测分析，也可用于常量物质的分离纯化。

在柱色谱法中，核心是起分离作用的色谱柱，而色谱柱中的填料又被认为是色谱柱的核心，其决定着物质的分离效果。因此色谱柱填料的化学、物理结构（如键结构、交联度、颗粒大小及其均匀性、孔径大小及其分布等）也起至关重要的作用。

色谱柱填料按照基质材料可分为三类：无机基质材料、多糖基质材料、和高聚物基质材料。

1.2.1 无机基质材料

无机基质材料包括硅胶、氧化铝、氮化物等，在高效液相色谱法中，硅胶基质材料的应用最为广泛，占液相色谱柱使用量的80%以上^[11-13]。因为硅胶填料机械强度高、比表面积大、表面易于修饰等优点，所以硅胶是无机色谱填料中最为重要的基质材料。

为了适应不同的分析目的，人们研究开发出多种用于不同分离模式的硅胶型色谱柱。此可通过硅胶表面具有的硅羟基与不同的硅烷化试剂，键合反应，达到对硅胶基质材料表面进行的各种化学修饰，使得其带有相应的功能基。如烷基、芳基、氰基、氨基等。除表面修饰外，硅胶基质材料还可整体进行进行聚合物包覆处理^{[14, 15]}。

虽然硅胶填料可以适用于多种分离模式，但其也存在以下缺点：（1）硅胶填料pH适用于范围较窄（pH适用范围2~8）^[16]，在强酸或强碱的条件下，Si-O键不稳定，易造成Si-O键断裂、硅胶破碎或键合基团脱落；（2）硅胶基质与疏水性碳链的键合，由于有位阻效应，必然会残留少部分未反应的硅羟基，此与被测样品易产生非特异性吸附，也会造成生物大分子变性，如：蛋白质、核酸等。由于硅胶存在这些缺点，研究人员将研究方向转向了有机基质材料。

1.2.2 多糖基质材料

多糖基质的原料一般为天然多糖化合物，先将其加工成凝珠，再经交联形成凝胶。多糖型凝胶基质含亲水性结构，在水溶性生物大分子分离方面具有良好的适用性。但该类色谱填料颗粒强度低，粒度较大，因此只适用于常压、低速条件。随着制备色谱填料技术的进步，出现了颗粒度小、颗粒强度较大的半硬质凝胶。应用较为广泛的有葡萄糖系凝胶基质^{[17, 18]}，如：Sephadax G系列；琼脂糖系凝胶，如：Sepharose系列。尽管如此，其仍不耐高压，不适用于有机相，因此使用范围存在较大局限。

1.2.3 高聚物基质材料

高聚物型基质材料是由小分子烯烃单体与交联剂通过C-C键聚合而成的高交联聚合物微球，如交联聚苯乙烯微球(Poly styrene-divinylbenzene，PS-DVB)。交联聚苯乙烯微球与无机硅胶基质填料相比，其化学性质更稳定，耐水、耐酸碱（pH适用范围1~14），且表面具有疏水的芳基，本身即具有疏水性，或无需额外键合疏水基团，因此对样品没有其非特异性吸附，已成为重要的高效液相色谱填料不可或缺的补充。

PS-DVB除了C-C键的化学稳定性而具有耐酸碱外，同样具有良好的颗粒刚性，小而均匀的粒度，适宜的孔径大小和分布，因此这是一种很好的色谱柱基质材料。但高聚物型色谱填料是有机结构，在相似相溶的有机良溶剂中，存在大幅度溶胀导致不耐压的缺陷。三十多年来，本课题组通过不断研究改进高聚物型色谱填料的合成技术^[19-25]，现制得的PS-DVB高聚物型色谱填料，在有机良溶剂中，可反复耐受40MPa压力而不影响使用。硅胶型色谱填料机械强度虽高，可耐受高压，但因反复加压使用而性脆易碎；高聚物型填料PS-DVB由于其在良溶剂中具有微小而不影响使用的溶胀，因此耐压更有韧性，即使反复加压或不易碎。

1.3 葛根素及大豆苷元的分离分析

葛根是野葛、甘葛藤这两个豆科植物的干燥根，早在本草纲目中就有葛根可入药的记载^[26]。在现代医学中，较多权威资料如《中药大辞典》等著述，其具有以下药理作用：扩张冠状动脉和脑血管、降血糖血脂、抗脂质过氧化和消除自由基、预防老年痴呆等作用^[26-29]。葛根提取液中主要有效成分为葛根素和大豆苷元等异黄酮类化合物。

葛根素亦称葛根黄素。它是从中药葛根中分离出来，并具有扩冠作用的异黄酮类衍生物。具有降低血管阻力，改善心、脑血液的循环,减慢心率,降低心肌耗氧量等作用。近年来有一些异黄酮类化合物用于畜牧业的报道,研究发现,异黄酮类物质能显著的促进动物生长,减少腹脂的沉积,改善繁殖泌乳性能,提高免疫力^[30]。

葛根素结构图

大豆苷元作为异黄酮化合物，其主要的来源在于豆科植物。如黄豆等，作为葛根和大豆的主要有效成分之一,具有明显的抗心律失常、抗缺氧缺血、解痉挛、雌性激素、促进骨细胞的形成和抑制癌细胞生长等作用^[31]。纯度较高的异黄酮类化合物更具有药用价值，但各类天然葛根中除了异黄酮类化合物，还含有其他有毒成分^[32]。为了得到纯度较高的异黄酮类化合物，葛根素的分析、分离技术得到研发人员的广泛关注。

大豆苷元结构图

葛根素、大豆苷元的分析方法种类有很多，如：紫外分光光度法^[33],其优点在于结果准确,重现性好,方法易行,且适用于制剂的质量控制，但缺点是有一定的选择性。毛细管气相色谱法检测葛根素衍生物中残留溶剂其优点实简单、快捷，且灵敏度高，可用于在葛根素衍生物中的残留溶剂的检测^[34]。但缺点是其柱容量小。本论文采用的是高效液相色谱法这个方法来测定葛根中的葛根素和大豆苷元样品与其杂质的分离度。其分离度较好，选择性高，重复性高。色谱柱多采用硅胶型色谱填料，此填料机械强度虽高，但其不耐酸碱^[16]；本工作选用PS-DVB为基质的高聚物型色谱柱（MKF- RP-HH）来对葛根提取液进行分离条件的研究与优化，其适用pH范围宽（pH 1-14），在良溶剂中具有微小而不影响使用的溶胀，因此耐压更有韧性，以期达到更好的分离分析效果。

第2章 实验部分

2.1 实验部分

2.1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国Dionex）：配备P680 HPLC泵、UVD-170U可变波长紫外检测器，AT-330柱温箱、8125型进样装置；液相色谱柱：PS-DVB高聚物色谱柱（MKF-RP-HH，南京麦科菲高效分离载体有限公司）；葛根提取原液（南京工业大学能能源所）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；Milli-Q Plus超纯水仪；葛根素（批号：YM0510YA14）和大豆苷元（批号：GR-133-131014）购于美国sigma公司。

2.1.2 液相色谱检测条件

色谱柱：MKF-RP-HH（300 mm×7.8 mm i.d.，8 μm）；流动相：A为水，B为甲醇；检测波长：250nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL；流动相在使用前分别用0.45μm的混合纤维膜和尼龙膜过滤，超声30min。

2.1.3 葛根素与大豆苷元的混合对照品溶液与葛根提取液的配置

葛根素（6.25mg/ml）和大豆苷元（5mg/ml）的混合对照品的储备液：精密称取葛根素62.5mg和大豆苷元50.0mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

葛根素（0.0625mg/ml）与大豆苷元（0.05mg/ml）的混合对照品溶液：精密量取葛根素（6.25mg/ml）和大豆苷元（5mg/ml）混合对照品储备液1ml，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45μm的尼龙滤头过滤，用来备用。

葛根提取液：精密量取2.5ml葛根提取原液，置于10mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度（即稀释4倍），用0.45μm的尼龙滤头过滤，备用。

2.2 结果与讨论

.2.2.1 流动相中甲醇的含量对葛根提取液分离效果的影响

在文献^[35]中，色谱柱为Symmetry C18（150 mm×3.9 mm i.d.，5 μm），流动相为甲醇和醋酸水溶液梯度条件洗脱，流速：1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长：250nm。虽然待测组分与相邻组分可达到基线分离，理论塔板数仅大于1000N/m。葛根提取液是一成分复杂的混合物，其中含有多种含氧杂环、氨基，羧基、醛基等极性基团宜与硅胶型色谱柱填料中残存的硅羟基发生非特异性吸附。另硅胶型色谱柱不耐酸、碱和水，易污染，难清洗和再生^[16]，而高聚物型色谱柱填料无残留羟基而无此非特异性吸附，且耐酸、碱和水，易清洗和再生^[36]，故先借鉴文献^[35]流动相体系，用高聚物型色谱柱测定葛根提取液，但结果较文献差。这是由于高聚物型色谱柱填料与硅胶型色谱柱填料存在结构差异，其最适流动相也必然有差别，故下文将对适合高聚物型色谱柱分离葛根提取液的最佳液相条件进行优化。

不同甲醇含量的等度流动相对葛根提取液分离的影响见图2。

图2 不同等度甲醇流动相条件下葛根提取液HPLC色谱图

Fig2 The HPLC chromatogram of different methanol gradient of kudzu extraction

由图2可知，在流动相为90%B时，出峰很快，分别在10min和16min处出了两个峰。降低甲醇浓度至50%B时，出峰时间有延迟，但分离度增大，即:在90%B时8-15min处的单峰可被分出多个连续的未分离的峰，说明随着甲醇浓度降低可改善分离度。继续降低甲醇浓度至40%B，除10min处的一组峰外，其它出峰时间都进一步延迟，分离度进一步增大，分别在10min，25min，33min出了三组相互分离的峰。再降低至30%，10min处的一组峰仍然存在，而第二个峰延至50min处，第三个峰70min时仍未出现，即除了10min峰不受甲醇浓度影响外，其余各峰出峰时间均随甲醇浓度降低而延迟。甲醇浓度低至30%时，虽然分离度最好，但出峰速度太慢，因此认为40%B为其中较好等度条件。

以上述不同等度流动相条件的结果，来测定葛根素和大豆苷元的混合物对照品溶液，以确定在不同等度甲醇浓度中，葛根素和大豆苷元在提取液中的归属。结果见图3。

图3 不同甲醇等度条件下葛根提取液和对照品溶液的HPLC色谱图

Fig3 The HPLC chromatogram of different methanol gradient of kudzu extraction

根据文献^[36-38]可知，葛根素出峰早于大豆苷元；葛根素在较低甲醇浓度下出峰，而大豆苷元在较高甲醇浓度下出峰。故由图3可知，流动相为90%等度甲醇浓度时，混合对照品溶液在9min和15min各出一个峰，分别为葛根素和大豆苷元。降低甲醇含量至50%时，混合对照品溶液在13min有一葛根素峰，而大豆苷元70min仍未出峰。在40%等度甲醇浓度下葛根素在20min出峰，大豆苷元更不出峰。由上述结果可知，葛根素及杂质峰随甲醇浓度降低而推迟出峰；而大豆苷元除在流动相为90%等度甲醇浓度中出峰，低于50%在70min内兼不出峰。

为了葛根提取液中既有良好的分离度，又使大豆苷元出峰，进一步改进流动相洗脱方式为梯度洗脱，洗脱结果见图4。

图4. 不同条件下洗脱提取液和对照品HPLC色谱图

Fig.4 The HPLC chromatogram of different methanol gradient of kudzu extraction and standard samples

a：杂质一；b：葛根素；c：杂质二；d：大豆苷元

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