论文总字数：27200字

摘 要

构建可以实现体内环化的萤火虫荧光素酶基因并在大肠杆菌中高效分泌表达环化酶，通过对其进行表达条件的优化，得到最终构建的菌株。通过单因素试验对接种量、培养基pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度进行优化设计，并结合各单因素诱导结果设计正交试验，探寻环化酶表达的最佳组合。单因素试验结果表明：4% 的接种量，培养基pH=7.0，终浓度为1mM的IPTG，诱导时机为1.296，诱导时间达5小时，诱导温度为25℃ 荧光素酶的表达量最高。正交试验结果表明:2%的接种量，终浓度为0.8mmol/L 的IPTG，摇床转速180 rpm/min, 30℃ 诱导时酶表达量最高，比酶活达1.14 x 10 ¹¹g RLU/mg。

关键词：环化 荧光素酶 表达 诱导 酶活

The construction of fluorescein cyclase and the optimization of the expressional conditions

Abstract

Constructing a fireflies' luciferase gene which can be cyclized internally and secretion express cyclase in the E.coli efficiently. We finally get the constructed strains through optimizing the expressional conditions. Studying on the optimization of the expressional conditions which containing inoculum size,medium pH,concentration of IPTG,revulsive opportunities,revulsive times and revulsive tempereture through single factor test . Meantime,we’re gonna design the orthogonal experiment combined with the results of different single factor inducing which aims to grope the best combination of cyclase's expression.The experiments of single factors show when the size is 4 %,the medium pH is 7.0,the concentration of IPTG is 1mM,the is 1.296,the revulsive times is 5 hours and the revulsive tempereture is 25 ℃,the luciferase has its best expression. The orthogonal experiment show when the size is 2%,the concentration of IPTG is 0.8 mM,the rotation speed is 180 rpm/min and the revulsive tempereture is 30 ℃, the luciferase has its best expression.

Key Words: Cyclization; Firefly luciferase; Expressional condition; Revulsive; Enzyme activity

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文 献 综 述 1

1.1荧光素酶简介 1

1.1.1荧光素酶应用现状 1

1.1.2 提高热稳定性的方法 2

1.2 蛋白质环化方法 3

1.3 本课题研究的目的与意义 4

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1菌种和载体 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3实验仪器 5

2.1.4 培养基 6

2.2实验方法 6

2.2.1引物的设计与合成 7

2.2.2目的基因的获取 7

2.2.3重组载体pET22b-label 1-linker-fl-linker-label 2构建 9

2.2.4重组子阳性克隆的筛选和鉴定 13

2.3荧光素酶的诱导表达 14

2.3.1荧光素酶的诱导表达 14

2.3.2的测定 14

2.3.3表达产物的酶活测定 15

2.3.4表达产物蛋白浓度的测定 15

2.3.5表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定 16

2.3.6热稳定性的测定 18

2.4 环化酶诱导表达条件的优化 18

2.4.1 培养基pH对目的蛋白产量的影响 18

2.4.2 接种量对目的蛋白产量的影响 19

2.4.3 IPTG浓度对目的蛋白产量的影响 19

2.4.4 诱导时机对目的蛋白产量的影响 19

2.4.5 诱导时间对目的蛋白产量的影响 20

2.4.6 诱导温度对目的蛋白产量的影响 20

2.4.7环化荧光素酶诱导表达条件正交设计 20

第三章 结果与讨论 22

3.1 pET22b-label 1-linker-fl-linker-label 2重组载体的构建 22

3.2环化荧光素酶的诱导表达 23

3.2.1表达产物的鉴定 23

3.2.2热稳定性的测定 24

3.3环化荧光素酶表达条件的优化 25

3.3.1培养基pH对目的蛋白产量的影响 25

3.3.2接种量对目的蛋白产量的影响 25

3.3.3 IPTG浓度对环化酶诱导表达的影响 26

3.3.4诱导时机对环化酶诱导表达的影响 27

3.3.5诱导时间对目的蛋白产量的影响 27

3.3.6诱导温度对目的蛋白产量的影响 28

3.4环化荧光素酶表达条件的正交设计 29

第四章 结论与展望 30

4.1结论 30

4.2展望 30

参考文献 31

致谢 32

第一章 文 献 综 述

1.1荧光素酶简介

萤火虫是昆虫纲鞘翅目萤科内可发出荧光的一类昆虫的总称^[1]，其腹部存在一层呈黄绿色的透明薄膜，该膜上存在的大量发光细胞为其发光提供了基础，而发光细胞内的主要物质为荧光素酶和荧光素。萤火虫荧光素酶( firefly luciferase, LUC )是生物体内催化脂肪醛氧化或荧光素发光的一类酶的总称^[2]，是一种可以使化学能转化成光能的高效生物催化剂，也是因为荧光素和荧光素酶的存在，使得萤火虫的发光效率极高，化学能高效转化为光能，且发光效率比人造光源高出数十倍，早在1884年，Dubois发现研磨后的萤火虫其荧光将迅速消失，但在重新加入萤火虫尾的新鲜提取物后又可以再次发出荧光^[3]。之后，其证明提取物中有荧光素与荧光素酶的相互作用，并指出在存在氧分子、ATP时，虫光素酶可催化荧光素氧化并发出荧光。化学反应如下：

荧光素 ATP O₂ = 氧化荧光素 AMP PPi CO₂ 光

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