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摘 要

锌指蛋白是能识别特定DNA序列并与之结合的一类小分子量蛋白。基于锌指蛋白能特异性结合DNA的特性，结合荧光素酶的发光特性，本实验拟通过锌指蛋白融合荧光素酶，构建一种高特异性的、高效的、能定量检测出食品中微生物含量的微生物快速检测元件。本实验中，通过构建小鼠基因调控因子Zif268的重组质粒并转化进入大肠杆菌B21（DE3）内，使具有生物活性的锌指蛋白得以在生物体外表达。并且，通过凝胶阻滞实验，证明体外表达的Zif268蛋白具有识别特定DNA序列并与之结合的能力。通过重叠PCR，以SC-FL-ST与Zif268为模板，PCR出Zif268和荧光素酶的结合基因。将其导入带大肠杆菌中，使其得以体外表达。通过凝胶阻滞实验与荧光反应证明融合蛋白具有生物活性。

关键词：锌指蛋白 荧光素酶 融合蛋白 重叠PCR 大肠杆菌 荧光反应

Construction of microbial rapid detection device

ABSTRACT

The zinc finger protein is a class of small molecules that recognize specific DNA sequences and combined with the amount of protein. Zinc finger protein specific binding characteristics based on DNA, combined with the luminescence properties of luciferase, the experiment of zinc finger protein luciferase fusion, to construct a high specificity, high efficiency, quantitative detection a device for rapid detection of microorganisms in food microbiology. In this experiment, and transformed into Escherichia coli B21 by recombinant plasmid Zif268 gene regulatory factor (DE3), the biologically active zinc finger protein expressed in vitro. And by EMSA, prove the in vitro expression of Zif268 has a recognition specific DNA sequences and binding capacity. By overlapping PCR, with SC-FL-ST and Zif268 as template, PCR gene with Zif268 and luciferase. It led to Escherichia coli, the in vitro Expression of fusion protein was demonstrated by gel retardation assay and fluorescence reaction.

KEYWORDS: Zinc finger protein；Luciferasefusion ；Protein；PCR；Escherichia coli； Fluorescence reaction

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 荧光素酶（Firefly Luciferase,FL）的基本特性 3

1.2.1 荧光素酶结构 3

1.2.3 发光原理反应 4

1.3 荧光素酶检测方法 4

1.4 锌指蛋白 4

1.4.1 锌指蛋白的基本特征 4

1.4.2 C₂H₂型锌指蛋白的结构 5

1.4.3 锌指蛋白对靶DNA的识别与结合 5

1.5 重叠延伸PCR 5

1.6 本课题研究的目的与意义 6

第二章 实验材料与方法 8

2.1 材料与仪器 8

2.1.1 实验材料 8

2.1.2 实验试剂与仪器 8

2.2 培养基的配制 9

2.3 抗性溶液与荧光反应液的配制 9

2.4 目的基因的扩增 10

2.5 表达载体pet22b-Zif268的构建与鉴定 10

2.6 重组菌的构建与Zif268的表达、纯化和浓缩 10

2.6.1 重组菌的构建 10

2.6.2 表达 10

2.6.3 纯化 11

2.6.4 浓缩 11

2.6.5 验证 11

2.7 凝胶阻滞实验证明Zif268生物活性 12

2.8 琼脂糖凝胶电泳实验 12

2.9 重叠延伸PCR一步法连接荧光素酶与Zif268基因 13

2.10 表达载体pet22b-FL-Zif268的构建 15

2.11 重组菌的构建和FL-Zif268基因的表达、纯化与浓缩 15

2.11.2 表达 15

2.11.3 纯化 16

2.11.4 浓缩 16

2.12 融合蛋白FL-Zif268生物活性的检测 16

2.12.1 荧光反应检测融合后荧光素酶活性 16

2.12.2 凝胶阻滞实验验证融合后锌指蛋白Zif268活性 17

第三章 实验结果及分析 17

3.1 目的基因的扩增与鉴定 17

3.1.1 Zif268与荧光素酶基因的扩增 17

3.1.2 表达载体pet22b-Zif268与pet22b-FL-Zif268的构建 17

3.2 Zif268的表达、纯化与其生物活性的验证 18

3.2.1 Zif268的表达与纯化 18

3.2.2 Zif268生物活性的检测 19

3.3 重叠延伸PCR融合FL与Zif268基因 19

3.4 FL-Zif268基因的表达与纯化 20

3.5 融合蛋白FL-Zif268的活性检测 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 引言

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