论文总字数：28870字

摘 要

丁二酸（succinic acid）是一种重要的C4平台化合物。利用工程大肠杆菌发酵生产丁二酸的过程中需要将pH维持在中性（6.6左右）以保证菌体的正常生理活性。按照这一工艺发酵产生的丁二酸在发酵液中主要以丁二酸盐的形式存在，增大了后续分离过程的难度和成本，同时发酵过程中需要使用大量缓冲液来维持pH，这也增加了发酵生产过程的成本投入。

经过研究发现，GAD系统是大肠杆菌体内最强的耐酸系统，由谷氨酸脱羧酶（GadA/B）和谷氨酸：γ-氨基丁酸（GABA）逆向转运子（GadC）组成。在酸性条件下，大肠杆菌会产生谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），这种酶能使细菌在较酸性的环境下生存。谷氨酸脱羧酶在是一种催化谷氨酸（glutamate）脱羧产生γ-氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）和二氧化碳，并消耗一个质子，从而使细胞内的pH逐渐恢复至适宜的pH范围内。

通过设计谷氨酸脱羧酶与谷氨酸：γ-氨基丁酸（GABA）逆向转运子基因gadBC的引物，对gadBC片段进行扩增和纯化，构建相应的载体并导入E.coli AFP111中，筛选并鉴定后进行两阶段发酵，探究其在不同酸性条件下的生长性能和发酵性能。

关键词：丁二酸；谷氨酸脱羧酶；耐酸性；大肠杆菌AFP111

Abstract

Succinic acid is an important platform chemical. Usually, producing succinic acid by E.coli need to maintain the pH at neutral (about 6.8) to keep the cells alive normally. Through this technics, succinic acid in products usually exists as succinates, which are hard to be separated. On the other hand, during the fermentation, a large among of buffer solution are used to maintain the pH, which cost high.

Research shows that the GAD system, which includes two kinds of glutamate decarboxylase (GadA and GadB) and a glutamate-γ-aminobutyric acid reverse transport vector, is the most effective acid resistance system which can make the bacteria to live in acidic environment. This kind of enzyme can catalyze glutamate to transform into γ－aminobutyric acid (GABA) and CO₂, and consumes a proton. As a result, the pH in cell would increase slightly.

Design the primer of the gene of glutamate decarboxylase and the glutamate- γ-aminobutyric acid reverse transport vector (gadBC), and then replicate and purify the gene. After that construct some corresponding primers and import them into E.coli AFP111. After screening and identification, explore the growth of the bacteria and the yield of succinic acid in different acidic environment by using two-stage fermentation.

Keyword: Succinic Acid, Glutamate Decarboxylase BC (GadBC), Acid Resistance, Two-stage Fermentation, Escherichia coli AFP111(E.coli AFP111)

目 录

第一章 文献综述 - 1 -

1.1 丁二酸的基本性质 - 1 -

1.2大肠杆菌发酵产丁二酸的代谢过程与调控 - 1 -

1.3 大肠杆菌的耐酸性 - 3 -

1.4 依赖于GAD的耐酸性系统的影响因素 - 3 -

1.4.1 细胞生长周期的影响 - 4 -

1.4.2 酸性环境的影响 - 4 -

1.4.3 渗透压的影响 - 5 -

1.5 研究目的 - 6 -

第二章 产琥珀酸大肠杆菌耐酸性菌株的构建 - 6 -

2.1 前言 - 6 -

2.2 菌种、试剂和仪器 - 7 -

2.2.1实验所用菌株和质粒 - 7 -

2.2.2 实验试剂、酶和试剂盒 - 7 -

2.2.3 实验仪器 - 8 -

2.2.4 培养基 - 9 -

2.3 实验方法 - 9 -

2.3.1 gadBC片段的扩增 - 9 -

2.3.2 载体的构建 - 10 -

2.3.3 感受态细胞的构建和质粒的转化 - 12 -

2.3.4 重组质粒的提取和酶切鉴定 - 13 -

2.3.5 扩增片段和质粒的鉴定 - 13 -

2.3.6 平板酸性冲击实验 - 13 -

2.3.7 生长曲线的测定 - 13 -

2.4 结果与讨论 - 14 -

2.4.1扩增片段和质粒的鉴定 - 14 -

2.4.2 平板酸性冲击试验 - 14 -

2.4.3 酸性条件下的菌体密度和生长曲线的测定 - 15 -

2.5 本章小结 - 16 -

第三章 考察GAD系统功能的加强对重组菌在酸性条件下发酵性能的影响 - 17 -

3.1 前言 - 17 -

3.2 材料、菌株和仪器 - 17 -

3.2.1 菌株 - 17 -

3.2.2 实验试剂 - 17 -

3.2.3 实验仪器 - 18 -

3.3 实验方法 - 19 -

3.3.1 有氧阶段pH为中性厌氧阶段pH为5.6的两阶段发酵 - 19 -

3.3.2 有氧阶段pH为中性厌氧阶段pH为5.0的两阶段发酵 - 19 -

3.3.3 有氧阶段和厌氧阶段pH均为5.6的两阶段发酵 - 20 -

3.3.4 检测方法 - 20 -

3.4 结果与讨论 - 20 -

3.4.1 有氧阶段pH为中性厌氧阶段pH为5.6的两阶段发酵结果 - 20 -

3.4.2 有氧阶段pH为中性厌氧阶段pH为5.0的两阶段发酵结果 - 21 -

3.4.3 有氧阶段和厌氧阶段pH均为5.6的两阶段发酵结果 - 22 -

3.5 本章小结 - 23 -

3.5.1 厌氧发酵在pH为5.6条件下的两阶段发酵 - 23 -

3.5.2 厌氧发酵在pH为5.0条件下的两阶段发酵 - 24 -

3.5.3 全程控制pH在5.6的两阶段发酵 - 24 -

第四章 总结与展望 - 25 -

4.1 总结 - 25 -

4.1.1 获得了一株GAD体系耐酸性菌株 - 25 -

4.1.2 两阶段发酵的pH调控考察酸性条件下的发酵性能 - 25 -

4.2 展望 - 26 -

4.2.1 菌株的进一步优化 - 26 -

4.2.2 发酵过程中的条件和培养基成分的控制 - 26 -

文献综述

1.1 丁二酸的基本性质

丁二酸又称琥珀酸，是微生物在厌氧环境下糖代谢过程中产生的有机酸，也是三羧酸循环过程中的重要中间产物。纯丁二酸为无色晶体，无嗅，有酸味，可燃，易溶于水、乙醇和丙酮等极性溶剂，几乎不溶于苯、四氯化碳和石油醚等非极性有机溶剂。丁二酸的结构式如图1-1。

图1-1 丁二酸的结构式

Fig 1-1 Structure of succinate

丁二酸是一种重要的C4平台化合物^[1]，在传统化工行业中主要依赖于石油炼制产生^[1]，但由于石油的不可再生性，利用生物发酵方法制备丁二酸的技术有很广阔的研究前景^[2]。

1.2大肠杆菌发酵产丁二酸的代谢过程与调控

大肠杆菌在厌氧条件下的糖代谢过程如图1-2所示。葡萄糖经由糖酵解过程生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP）。在高CO₂浓度下PEP能转化为草酰乙酸（oxaloacetic acid, OAA），进而生成苹果酸（Malate）再转化为富马酸（Fumarate），最后生成丁二酸。而在低CO₂浓度下则会生成乙酸或乙醇。由此可以看出，可以利用工程大肠杆菌发酵产丁二酸^[3-11]。

图1-2 大肠杆菌在厌氧条件下的糖代谢

Fig 1-2 Sugar metabolism of Escherichia coli under anaerobic conditions

通过敲除乳酸脱氢酶的编码基因（ldhA）和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因（pflB）,使菌体在厌氧发酵条件下产生的主要产物为丁二酸而不产生乳酸和甲酸，但同时由于依赖于NADH的乳酸脱氢酶（LDH）无法合成而限制了糖酵解过程中NADH再生为NAD 的过程，造成辅酶不平衡使糖酵解过程无法进行，丙酮酸不能大量积累。NAD(H)合成与分解的途径如图1-3。

图1-3 大肠杆菌内NAD(H)合成与分解的途径

Fig 1-3 The synthesis and decomposition of NAD (H) in Escherichia coli

突变了葡萄糖转运系统中ptsG基因的菌株可以降低EMP途径中NADH的产生速率，恢复了NADH与NAD 的平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖同时产生丁二酸。因此，维持辅酶的平衡是保证丁二酸高产的关键因素。

另外，通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶和NAD 合成酶，能够增大细胞内NAD（H）的含量，使其含量不再成为酶转化的限制因素，从而提高了酶转化的效率。

1.3 大肠杆菌的耐酸性

pH值的高低对于细菌体内的各类生化反应以及蛋白质活性的影响很大，人类胃中的酸性环境（pH≈2）能够杀死大多数的微生物，但是在Escherichia coli中有三种耐酸系统增强菌体的耐酸性能以保证细菌能顺利通过酸性较强的胃到达肠道。第一是依赖于由RpoS编码的σ^S 因子的耐酸系统^[12]；第二是ARG耐酸系统^[12]，包括由精氨酸脱氨酶、鸟氨酸-氨甲酰磷酸转移酶、氨基甲酰激酶组成了三个反应，首先精氨酸脱氨酶催化精氨酸脱氨生成鸟氨酸和氨，其次鸟氨酸-氨甲酰磷酸转移酶催化瓜氨酸磷酸化生成鸟氨酸和氨基甲酰磷酸，最后氨基甲酰激酶催化氨基甲酰磷酸和ADP 生成ATP、CO₂和NH₃，且这些反应都是可逆的；第三是GAD耐酸系统^[12]，这套系统成分包括由gadA和gadB编码的谷氨酸脱羧酶的两种异构体GadA与GadB和由gadC编码的谷氨酸-γ-氨基丁酸逆向转运子GadC组成^[13]。其中，在E.coli体内GAD系统为耐酸性能力最强的系统。

谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）是一种催化谷氨酸（Glutamaic acid，Glu）脱羧形成γ-氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）的酶，这一过程中消耗一个质子。谷氨酸脱羧酶一般有两种异构体：GadA和GadB，分别由两个基因gadA和gadB编码。另外，由gadC基因表达的一种特异性的逆向转运载体GadC，用于从细胞内向胞外转运γ-氨基丁酸，有助于减少细胞内产物浓度，以此使细胞产生耐酸性^[12]。

细胞外的强酸性环境降低了细胞质内的pH，从而激活了谷氨酸脱羧酶的表达。细胞膜内外的质子梯度会使质子化的谷氨酸转运至胞内，在细胞内谷氨酸在GAD的催化下脱羧形成GABA和CO₂，脱羧过程中会消耗H 因而使pH升高，因而使细胞产生耐酸性。

1.4 依赖于GAD的耐酸性系统的影响因素

谷氨酸脱羧酶的转录调节过程十分复杂，早前的研究证实gadA和gadBC的表达可能受到三种因素的影响。

1.4.1 细胞生长性能的影响

在细胞生长的不同阶段谷氨酸脱羧酶的表达存在较大的差异，在指数增长期细胞几乎不产生谷氨酸脱羧酶，而在进入稳定期后细胞则会产生大量的谷氨酸脱羧酶。这一现象的出现主要是因为H-NS蛋白的存在，H-NS是E.coli的一种核蛋白，它能与转录启动子上游的DNA结合，阻碍基因的表达^[15]。

1.4.2 酸性环境的影响

酸性pH 能够诱导gadA 和gadBC 基因的大量表达。这种诱导作用是通过诱导转录激活因子的生物合成而实现的多级调控。

在酸的诱导下，由gadX和gadW表达合成的两种转录因子GadX和GadW会影响gadBC和gadA的表达。其中，gadX与gadA处于同一个操纵子且位于gadA的下游，gadW则位于gadX的下游。位于gadBC和gadA上游的一段称为GAD box的约为20个碱基对的DNA序列是转录因子GadW和GadX的结合位点^[15]。

在任何pH条件下gadX基因均能表达，一方面，其作用于gadBC基因使其激活，另一方面它也能激活gadAX转录子使其产生更多的GadX形成一个自发调控环。实验证明，在酸性条件下，GadX是一种首先被诱导的转录激活因子，gadA和gadBC基因在酸性条件下被激活主要是由于gadX 基因的表达^[15,16]。

1. 通常情况下GadX的激活作用 （b）gadX基因敲除后GadW的激活作用

和GadW的阻遏作用

（c）GadE的激活作用

图1-4 酸性条件下gad基因表达的调控

Fig 1-4 Regulation of gad gene expression under acidic conditions

而GadW对gadA 和gadBC基因的表达的调控具有双重性^[16]。通常情况下，GadW会阻遏gadX基因的表达从而间接阻碍gadA和gadBC的表达（如图1-4a）。但是，若gadX基因被敲除，则GadX则会对gadA和gadBC起到激活的作用（如图1-4b）。

另外在E.coli中还存在一种转录调控因子GadE^[17]，它直接作用于gadA和gadBC的GAD-box以激活其表达。与GadX不同的是：GadE对gadA/BC基因的激活不依赖于培养条件和细胞生长周期。gadE基因的组成型表达能使gadA/BC 基因表达在很大程度上不再受pH的影响。gadE的插入突变能使细菌的耐酸性系统全部失效, 表明GadE也是大肠杆菌耐酸性系统的多功能调控蛋白（如图1-4c）。

图1-5 gadA基因与gadBC操纵子

Fig 1-5 gadA gene and gadBC operon

GadB和GadC都具有很强的pH值依赖性。当pH gt; 5.6时，GadB游离在细胞质中，pH lt; 5.6时，GadB结合于细胞膜的上，而此时它能够更有效的调控胞内的pH值^[15]。Shi et al曾报道GadC转运的最高活性在pH5.5上下^[30,31]，在pH ≥ 6.5时，GadC不具有转运活性。

1.4.3 渗透压的影响

过高或过低的渗透压都会激活E.coli中的gadA和gadBC基因，使其过量的表达^[18]。高渗时，K 快速进入细胞，破坏细胞DNA的拓扑结构，使H-NS蛋白失效而导致gad基因的激活。低渗时，细胞内的σ^S因子含量增大，促进gad基因的表达。

1.5 研究目的

大肠杆菌NZN111是一株敲除了乳酸脱氢酶基因（ldhA）和丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）的工程菌株，其厌氧发酵的主要产物为丁二酸。但由于NAD(H)平衡调节过程所依赖的乳酸脱氢酶（LDH）无法无法合成而破坏了NAD(H)的平衡，使糖酵解过程无法进行。AFP111是工程大肠杆菌NZN111的一个突变菌株，它突变了与葡萄糖转运系统相关的pts基因，降低了EMP途径中NADH的生成速率，恢复了NAD(H)的平衡，维持了厌氧条件下EMP途径的持续进行，故而是一株生产丁二酸的优良菌株。

在AFP111的厌氧发酵阶段需要维持pH值中性（6.6左右），发酵过程需要使用大量的Na₂CO₃作为缓冲，导致发酵液中的丁二酸都以丁二酸盐的形式存在，增大了后续过程中产物分离的难度和成本。为解决这一问题，本实验从一株E.coli NZN111的突变菌株E.coli AFP111出发，需要增强这一菌株的耐酸性以降低其在发酵和分离过程中的成本并简化工序。

首先进行耐酸性菌株的构建。通过设计gadBC的引物，以E.coli K12基因组为模板，将设计纯化扩增后的引物导入E.coli AFP111中，获得大量表达耐酸性基因gadBC的菌株。随后验证重组细菌对低pH的耐受性并测试其在酸性环境下的丁二酸生产能力，确定重组菌株能够在低pH条件下生产丁二酸。

第二章 产琥珀酸大肠杆菌耐酸性菌株的构建

2.1 前言

由于谷氨酸脱羧酶GadB能够在细胞内催化谷氨酸脱羧转化为γ-氨基丁酸，反应过程可以调节细胞内的pH，因而使细胞能在酸性环境中维持体内的pH稳定。另外，一种逆向转运载体GadC能够将产物γ-氨基丁酸转移到细胞外，促进反应的进行。调控这两种蛋白的基因位于同一个操纵子上，故将这段基因的过表达能够使细胞产生较强的耐酸性。

利用E.coli AFP111这一丁二酸的高产菌株作为原始菌株，通过导入扩增纯化后的gadBC基因使其在该菌体内过量表达，能够使菌体在偏酸性环境下生存并生产丁二酸。

2.2 菌种、试剂和仪器

2.2.1实验所用菌株和质粒

本实验所用的E.coli AFP111(F λ-rpo S396(Am)rph-1 ΔpflAB::Cam ldhA::Kan ptsG)是E.coli NZN111的一个突变菌株，由David P. Clark教授(Southern Illinois University)惠赠。质粒pMD19-T购买自Takara公司。详见表2-1。

表2-1本实验所用质粒与菌株

Table 2-1 Bacterial strains, plasmids, and primers used in this charpter

2.2.2 实验试剂、酶和试剂盒

见表2-2和表2-3。

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