论文总字数：22182字

摘 要

甘露醇（D-Mannitol）在工业领域应用广泛。现有的甘露醇生产通过加氢法制备，会产生大量山梨醇，增加了分离难度，导致成本居高不下。而微生物发酵法制备甘露醇过程中不产生山梨醇，因此，通过生物法制备甘露醇具有良好的应用前景。

异型肠膜明串珠菌在厌氧条件下通过磷酸戊糖途径利用糖类产生能量，而此时果糖则会在甘露醇脱氢酶催化下转化为甘露醇，并产生乳酸等代谢产物。因此,肠膜明串珠菌可在异型乳酸发酵过程中同时产生乳酸和甘露醇两种产品。

本文研究了Leuconostoc pseudomesenteroides G123的发酵性能，考察了底物组成、产物浓度、还原性辅酶前体物质对其厌氧发酵性能的影响，随后通过补料及膜循环生物反应器重复批式发酵等调控手段优化发酵工艺。相关研究显示：以55%的果葡糖浆为碳源的种子培养基，发酵初糖浓度为120g/L，其中果糖和葡萄糖比例为1:0.25，初始pH为7.5，发酵过程中保持pH为4.5，在添加5mg/L烟酸条件下，甘露醇产量可达69.18g/L，甘露醇对果糖的转化率为87.3%，该过程副产D-乳酸37.17g/L。在此基础上开展了补料分批发酵研究，甘露醇产量达63.33g/L，甘露醇对果糖的转化率增加至94.79%，并副产D-乳酸26.67g/L。利用膜循环生物反应器收集发酵后的菌体直接进行第二批次发酵，产甘露醇56.26g/L，甘露醇对果糖的转化率增加至97.16%，副产D-乳酸22.41g/L。在此基础上还研究了乙醇、乳酸对甘露醇溶解度的影响。

关键词：假肠膜明串珠菌，甘露醇，D-乳酸，厌氧发酵

Abstract

D-Mannitol are used widely in industries. Traditionally, mannitol production costs very high. Therefore, the price of mannitol is always high. However, producing mannitol by fermentation would not produce sorbitol. As a result producing mannitol by microbial fermentation would have a wide range of use in the future.

In anaerobic environment, the special Leuconostoc mesenteroides can only produce energy by Hexose Monophophate Pathway(HMP). Meanwhile, fructose would be transform into mannitol by mannitol dehydrogenase and the final productions are lactic acid, ethanol and carbon dioxide. According to these pathway, the cell can produce lactic acid and mannitol at the same time.

Through the study of the fermentation of Leuconostoc pseudomesenteroides G123l, we can explore the effect of substrate composition, product concentration and reductive coenzyme precursors on the anaerobic fermentation of the coenzyme. And then optimized the fermentation process by repetitive batch fermentation and feeding and membrane cycle bioreactor to confirme the production process of fermenting mannitol and lactic acid. Fermentation results showed that should use 55% fructose as carbon source of seed medium, and at the beginning of the sugar concentration was 120g/L, and the fructose and glucose was in proportion to 0.25, and adding 5mg / L nicotinic acid, initial pH of 7.5, fermentation process maintaining pH 4.5, mannitol production could up to 69.18g/L and mannitol on fructose conversion rate was 87.3%. In this process the D-lactate production was 37.17g/L. On the fed batch fermentation, in the first batch fermentation, mannitol production reached 63.33g/L and mannitol on fructose conversion rate was 94.79%. The by-product of D-lactic acid production was 26.67g/L. Using the membrane cycle bioreactor to recycle the first batch fermentation bacteria to use them in the second batch fermentation. Finally got 56.26g/L mannitol and mannitol on fructose conversion rate was 97.16% and D-lactic acid production was 22.41g/L. The effect of ethanol and lactic acid on the solubility of mannitol was also studied.

Keywords: Leuconostoc pseudomesenteroides；D-Mannitol；D-Lactic Acid；Anaerobic Fermentation.

目 录

第一章 文献综述 - 1 -

1.1 甘露醇的性质和传统生产方法 - 1 -

1.2 乳酸的性质与乳酸菌发酵 - 1 -

1.3 明串珠菌与异型乳酸菌发酵 - 2 -

1.4 本文的研究目的及内容 - 3 -

1.4.1 研究内容 - 3 -

1.4.2 研究目的 - 3 -

第二章 假肠膜明串珠菌发酵产甘露醇和乳酸 - 4 -

2.1 前言 - 4 -

2.2 材料、设备与菌株 - 4 -

2.2.1 菌株 - 4 -

2.2.2 实验试剂 - 4 -

2.2.3 实验仪器 - 5 -

2.2.4 培养基 - 5 -

2.3 实验方法 - 6 -

2.3.1 种子培养 - 6 -

2.3.2 种子培养基碳源组成的研究 - 6 -

2.3.3 甘露醇产物抑制的研究 - 6 -

2.3.4 不同初糖浓度甘露醇发酵性能的研究 - 7 -

2.3.5烟酸调控甘露醇发酵的研究 - 7 -

2.3.6考察发酵过程补加烟酸对甘露醇生产的影响 - 7 -

2.3.7菌体重复发酵的探索 - 7 -

2.3.8 改变发酵碳源中果糖比例的研究 - 8 -

2.3.9 补料分批发酵与中空纤维膜循环反应器重复发酵研究 - 8 -

2.4 结果与讨论 - 9 -

2.4.1 种子培养基碳源组成对发酵性能的影响 - 9 -

2.4.2 甘露醇浓度对发酵性能的影响 - 9 -

2.4.3 初糖浓度对甘露醇发酵性能的影响 - 10 -

2.4.4烟酸对发酵性能的影响 - 11 -

2.4.5 菌体重复利用的可行性 - 12 -

2.4.6果糖比例对发酵性能的影响 - 12 -

2.4.7 发酵过程中补加烟酸对甘露醇生产的影响 - 13 -

2.4.8补料分批发酵与细胞循环利用对发酵性能的影响 - 14 -

2.5 本章小结 - 14 -

第三章 产物甘露醇溶解度的研究 - 15 -

3.1 前言 - 16 -

3.2 实验材料 - 16 -

3.2.1 实验试剂 - 16 -

3.2.2 实验仪器 - 16 -

3.3 实验方法 - 17 -

3.3.1 不同乙醇体系中的甘露醇溶解度 - 17 -

3.3.2 不同乳酸浓度下的甘露醇溶解度 - 17 -

3.3.3 5%乳酸-50%乙醇-水体系中的甘露醇溶解度 - 17 -

3.4 结果与讨论 - 17 -

3.4.1 乙醇对甘露醇溶解度的影响 - 18 -

3.4.2 乳酸对甘露醇溶解度的影响 - 18 -

3.4.3 5%乳酸-50%乙醇-水体系中温度对甘露醇溶解度的影响 - 19 -

3.5 本章小结 - 19 -

第四章 结论与展望 - 20 -

4.1 结论 - 21 -

4.2 展望 - 21 -

第一章 文献综述

1.1 甘露醇的性质和传统生产方法

甘露醇（D-Mannitol），又称为己六醇、甘露糖醇或木蜜醇，是一种多元糖醇。分子式为C₆H₁₄O₆，相对分子质量为182.17，甘露醇的结构式如图1-1。

图1-1 甘露醇结构式

甘露醇易溶于水，难溶于乙醚，其溶解度随温度的升高而升高，水溶液呈酸性。甘露醇在食品工业和医药领域有着广泛的应用^[1,2,5]，所以甘露醇拥有成熟的市场和广阔的应用前景。

目前主要采用的甘露醇生产方法是催化加氢法，该方法以镍作为催化剂，在高温高压条件下催化葡萄糖与果糖（1:1）的混合物加氢还原，其中葡萄糖全部转化为山梨醇，果糖中的一半转化为甘露醇，而另一半则转化为山梨醇，产物中山梨醇和甘露醇的比例为3:1。催化加氢法的成本很高，同时甘露醇的得率低，而低附加值的山梨醇和甘露醇的分离纯化需要通过色谱分离，增加了生产成本。因此化学法合成甘露醇限制其需求的进一步拓展 ^[6,7]。

1.2 乳酸的性质与乳酸菌发酵

乳酸（lactic acid），即2-羟基丙酸，分子式为C₃H₆O₃，一般为无色澄清或微黄色的粘性液体，与水、乙醇或乙醚能任意比例互溶，在氯仿等有机溶剂中不溶，水溶液呈酸性，其结构式如图1-2所示。

图1-2 乳酸的结构式

乳酸可广泛应用于食品、医药、农业、工业等领域。D-乳酸主要存在于细菌的细胞壁、芽孢杆菌属的孢子和某些植物细胞内，人体因只有分解L-乳酸的酶（L-乳酸脱氢酶）而不能代谢D-乳酸，因此D-乳酸不能应用于食品领域。但是D-乳酸在新材料、制药、农药等领域具有广泛的应用，可用于合成高效低毒的农药，可合成可生物降解的塑料聚乳酸等，目前其价值远远超过L-乳酸。

乳酸在工业上的制备方法主要有合成法和发酵法。合成法包括乳腈法和丙烯腈法，但制得的乳酸为DL型混合物，同时由于原料来自石油化工产品，不具有竞争力。发酵法则因以可再生资源为原料、安全性高、可产高光学纯度的乳酸（D型、L型）等优点，已经成为国内外工业化生产乳酸的主要方法。至2008年，世界上90%的乳酸采用发酵法生产。

发酵法主要是在乳酸菌作用下，在厌氧环境中将糖转化为乳酸。乳酸发酵阶段能够产酸的乳酸菌很多，但依据菌系的发酵途径不同，可以分为同型乳酸菌和异型乳酸菌。根据发酵过程中代谢途径的不同，可以将乳酸菌的发酵途径分为同型乳酸发酵和异型乳酸发酵两类。同型乳酸发酵中一分子葡萄糖经过糖酵解途径（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP途径）只产生两分子的乳酸。异型发酵中葡萄糖经由磷酸戊糖途径（Hexose Monophophate Pathway，HMP途径），发酵还能产生乙酸、乙醇和CO₂等副产物^[4]。

1.3 明串珠菌与异型乳酸菌发酵

明串珠菌是一类典型的异型乳酸菌，由于该菌中没有果糖-1,6-二磷酸醛缩酶，故果糖会在甘露醇脱氢酶作用下直接转化为甘露醇。因此明串珠菌等异型乳酸菌的乳酸发酵过程可同时产生甘露醇和乳酸两种产物^[8-10]。先前的研究表明，假肠膜明串珠菌发酵产生的乳酸中，99.95%为D-乳酸，有很高的附加价值。

明串珠菌的代谢途径见图1-3。明串珠菌代谢葡萄糖时，首先一分子葡萄糖脱羧产生一分子CO₂和一分子戊糖，随后这一分子戊糖经由磷酸戊糖途径产生三碳化合物（3-磷酸甘油醛）和一分子二碳化合物（乙酰磷酸），这条途径在异型乳酸菌中也称为磷酸转酮酶途径。最终3-磷酸甘油醛转化为丙酮酸再还原为乳酸，乙酰磷酸则还原为乙醇或者乙酸，生成乳酸和乙醇是为了再生NAD 维持菌株代谢，其发酵1mol葡萄糖时生成1mol ATP，而同型乳酸菌发酵1 mol葡萄糖时可生成2mol ATP ^[6]。明串珠菌还可以利用果糖激酶将果糖磷酸化，生成6-磷酸果糖，在磷酸葡萄糖异构酶作用下生成6-磷酸葡萄糖，进入磷酸转酮酶途径。而果糖在甘露醇脱氢酶的作用下直接还原为甘露醇，同时伴随生成NAD ，该反应减少了代谢所需来自生成乙醇时产生的NAD ，增加了乙酸产量，从而产生了更多的ATP，使菌株获得较高的比生长速率^{[9, 10]}。

图1-3 明串珠菌的糖代谢途径

图中：1.甘露醇脱氢酶 2.己糖激酶 3.葡萄糖磷酸异构酶

1.4 本文的研究目的及内容

1.4.1 研究内容

本文以Leuconostoc pseudomesenteroides G123为研究对象，考察该菌株联产甘露醇和D-乳酸的可行性。

以葡萄糖和果糖的混合糖作为碳源发酵产甘露醇，通过降低种子培养碳源成本，在廉价培养基的基础上对高糖浓度下的厌氧发酵过程进行初步调控进一步优化发酵条件，提高甘露醇的产量。

研究补料分批发酵制备甘露醇的可行性，比较其生产性能能。在此基础上构建膜循环生物反应器，进一步提高生产效率。

对甘露醇和D-乳酸开展分离提取研究，考察甘露醇的溶解度规律，为今后用乙醇沉淀法将甘露醇与D-乳酸分离提供基础数据。

1.4.2 研究目的

本文的预期目标是探索假肠膜明串珠菌生产高附加值产品的性能，选定了甘露醇和D-乳酸作为主要研究对象，优化发酵工艺，提高生产效率，降低生产成本，为之后的产业化研究提供基础数据。

第二章 假肠膜明串珠菌发酵产甘露醇和乳酸

2.1 前言

乳酸菌的异型发酵途径使得其能够在厌氧条件下同时产生甘露醇和乳酸，且异型乳酸菌能够将果糖完全转化为甘露醇，相对于化学合成法而言产物中不存在山梨醇，这大大降低了后续分离的难度和成本。

请支付后下载全文，论文总字数：22182字