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摘 要

微生物肥料是一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，能获得特定的肥料效应，在这种效应的产生中，制品中活微生物起关键作用。γ-聚谷氨酸( γ-PGA )是有活微生物合成的一种细胞外高分子多氨基酸聚合物，由谷氨酸单体通过 α-氨基和 γ-羧基缩合而成，是一种对人体和环境无毒害的生物相容性天然高分子物质，在农业、食品和医药等领域具有广泛的应用前景。本文从 γ-PGA 产生菌的筛选、鉴定、发酵条件优化等方面进行了研究。

1. 从煮沸的微生物菌剂中富集所需菌株，再经过分离纯化后筛选出所需菌株，通过简单摇瓶发酵筛选产聚谷氨酸菌株，最后通过简单的形态观察及再使用 16S rRNA序列分析进行菌种鉴定，确定筛选菌株为Bacillus subtilis sp. J9，并得聚谷氨酸的分子量为541141.42722 kDa。
2. 以菌株Bacillus subtilis sp. J9为研究对象，γ-PGA为最终目标，进行发酵条件和发酵培养基成分的优化。即对时间、温度、碳源、氮源和谷氨酸钠进行优化研究。再选取合适的四个因素进行四因素三水平的正交实验，通过实验分析得出最佳培养基配方为：甘油35 g/L、硝酸铵8 g/L、谷氨酸钠30 g/L、KH₂SO₄1 g/L、Mg² 0.2 g/L、Fe² 0.02 g/L，pH7.1，振荡培养48 h。产量达28.328 g/L。

关键词: γ-聚谷氨酸 16S rRNA序列分析 发酵优化 正交设计

Abstract

Microbial fertilizer is a type of specific product containing the living microorganism. It can obtain specific fertilizer effects while being applied to the agricultural production. In the production of such effects, the living microorganism in the products plays a pivotal role. γ-PGA is an extracellular high-molecular polymer with multiple amino acids in synthesis of the living microorganism. It is from the condensation of glutamic acid monomer through α-amino and carboxy-γ. It is a biocompatible nature macro-molecule material without any hazard to human body and the environment, which has an extensive application prospect in fields like Agriculture, Food, Medicine and so on. This paper conducts researches on such aspects as screening, identification and optimization of fermentation conditions of γ-PGA producing bacteria.

(1) Enrich the required bacterial strain from boiled microbial agent; screen out the required bacterial strain through separation and purification; screen out the bacterial strain which produces the polygamist acid through the simple flask shake and fermentation; at last, conduct the strain identification through a simple morphologic observation and reuse of 16S rRNA sequence analysis. As a result, it is confirmed that the screened strain is Bacillus subtilis sp. J9, and the molecular weight of polyglutamic acid is 541141.42722 kDa.

(2) Take the bacterial strains of Bacillus subtilis sp. J9 as the object of study, and the γ-PGA as the final objective, and carry out the optimization of the fermentation conditions and fermentation medium components. Namely, carry out the optimization research on the time, temperature, carbon source, nitrogen source and sodium glutamate. Then four appropriate factors are chosen to perform the four-factor and three-level orthogonal experiment, and the optimum culture medium formula obtained through the experimental analysis is: glycerin 35 g/L, ammonium nitrate 8 g/L, glutamate 30 g/L, KH₂SO₄ 1 g/L, Mg² 0.2 g/L, Fe² 0.02 g/L, pH 7.1, and the vibration culture for 48 h. The yield reaches 28.328 g/L.

Key words: γ-PGA; 16S rRNA molecules; Orthogonal design; Fermentation

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 微生物肥料 1

1.1.1 微生物肥料简介 1

1.1.2 作用机理 1

1.1.3 发展趋势 1

1.1.4 微生物肥料在农业生产上的作用 2

1.1.5生物有机肥对植物土传病害的防治 3

1.2 γ-聚谷氨酸 3

1.2.1 γ-聚谷氨酸简介 3

1.2.3 性质 4

1.2.4 γ-聚谷氨酸的应用 4

1.3 16S rRNA序列菌种鉴定 4

1.4 本论文研究的主要内容及意义 5

1.4.1 研究内容 5

1.4.2 研究意义 5

第二章 材料与方法 6

2.1 菌株来源 6

2.2 实验器材和试剂 6

2.3 培养基及培养条件 7

2.4 实验步骤 7

2.4.1 菌种筛选及鉴定 7

2.4.2 黏性物质的定性 7

2.4.3 发酵优化 7

2.5 实验方法 8

2.5.1 菌种筛选方法 8

2.5.3 发酵条件单因素优化 12

2.5.4 发酵培养基单因素优化 12

2.5.5 正交试验 13

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 发酵条件单因素优化 14

3.1.1 发酵时间对 γ-PGA合成的影响 14

3.1.2 发酵温度对 γ-PGA合成的影响 14

3.2 发酵培养基单因素优化 15

3.2.1 碳源对 γ-PGA合成的影响 15

3.2.2 谷氨酸钠对 γ-PGA合成的影响 16

3.2.3 氮源对 γ-PGA合成的影响 16

3.3 正交优化 17

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 23

1. 文献综述

1.1 微生物肥料

1.1.1 微生物肥料简介

微生物肥料是一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，能获得特定的肥料效应，在这种效应的产生中，制品中活微生物起关键作用^[1]。微生物肥料产品中必须含有活的特定微生物，在农业生产中应用能够获得特定的肥料效应，并且这种肥料效应的产生主要来源于微生物的代谢。通过微生物的生命活动，能够改善长期施用化肥所引起的土壤肥力下降等状况，并且有益微生物种群能够在根际土壤中形成优势群体，从而对致病菌形成一定的拮抗作用，减轻作物病害。同时，施用微生物肥料还可以提高作物品质、改善土壤质量、降低生产成本、改善土壤环境，具有极大的优势。

1.1.2 作用机理

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