论文总字数：15022字

摘 要

L-酪氨酸是一种芳香族、非必须氨基酸，参与了蛋白质的构成，在医药、化工、饲料产业中得到普遍运用。L-酪氨酸的制备方法有多种，主要是提取法、发酵法、化学合成法等，本文选用酶法。先将对羟基苯甲醛和海因在乙醇胺催化剂作用下，化学法缩合生成对羟基亚苄基海因，再碱解成底物对羟基苯丙酮酸。采用来自大肠杆菌的L-天冬氨酸转氨酶，以L-天冬氨酸为氨基供体，对碱解液进行催化转氨，生成产物L-酪氨酸。本实验对碱解反应生成对羟基苯丙酮酸的工艺条件和L-天冬氨酸转氨酶的催化条件摸索探讨，L-酪氨酸的转化率达到92.41%。

关键词：对羟基亚苄基海因 对羟基苯丙酮酸 L-天冬氨酸转氨酶 L-酪氨酸

Preparation of L-tyrosine by enzyme method

Abstract

There are 20 common amino acids component of proteins, including L-tyrosine. L-tyrosine is nonessential, aromatic amino acid, and has been generally applied to medicine, chemical industry and feed industry. A lot of means has been developed to prepare L-tyrosine, such as, extraction, fermentation, chemical synthesis and so on. In this study, we prepared L-tyrosine from p-hydroxy phenylpyruvic acid by enzyme method. The substrate p-hydroxy phenylpyruvic acid was synthesized by alkaline hydrolysis using 5-(p-hydroxy)-benzalhydantoin, which was prepared from p-hydroxy benzaldehyde and sodium hydroxide. L-tyrosine was produced by means of biotransformation of p-hydroxy phenylpyruvic acid and L-aspartic acid using L-aspartate aminotransferase from E.coli with a conversion rate of 92.41％.

Key Word:5-(p-hydroxy)-benzalhydantoin; p-hydroxy phenylpyruvic acid; L-aspartate aminotransferase; L-tyrosine

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 L-酪氨酸的概述 1

1.1.1 L-酪氨酸的简介 1

1.1.2 L-酪氨酸的应用 1

1.1.3 L-酪氨酸生产的发展现状 2

1.2 L-酪氨酸的制备 2

1.2.1 提取法 2

1.2.2 直接发酵法 3

1.2.3 酶转化法 3

1.2.4 化学合成法 4

1.2.5 化学-酶法 4

1.3 L-酪氨酸的提取与纯化 6

1.4 L-酪氨酸的鉴定 6

1.5 本课题的研究思路 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 仪器 8

2.1.2 试剂 9

2.2 分析测定方法 9

2.2.1 HPLC法检测含量 9

2.2.2 微机熔点仪测定L-酪氨酸的熔点 10

2.2.3 L-酪氨酸比旋度的测定 10

2.2.4 质量标准 10

第三章 实验步骤与数据 12

3.1 菌体的准备 12

3.2 对羟基亚苄基海因的制备 12

3.3 酶转化原料对羟基苯基丙酮酸的碱基制备 13

3.4 酶转化 13

3.5 L-酪氨酸的提取 14

第四章 结果与讨论 16

4.1 对羟基苯基丙酮酸的碱基制备 16

4.1.1 反应温度对收率的影响 16

4.1.2 碱用量对收率的影响 16

4.2 酶转化 17

4.2.1 湿菌体加量（酶浓度）的影响 17

4.2.2 氨基供体天冬氨酸加量的影响 18

4.3 L-酪氨酸的提取方式的影响 19

第五章 总结与展望 20

5.1 总结 20

5.2 展望 21

参考文献 22

致谢 24

文献综述

L-酪氨酸的概述

L-酪氨酸的简介

酪氨酸的学名可以称之为：DL-β-对羟基苯基丙氨酸（混旋或消旋体结构），它的分子式可以表达为C₉H₁₁NO₃ ，从手性光学空间结构来看，拥有L构型的酪氨酸和D构型的酪氨酸这两种不同光学结构的对映体。其中，L-酪氨酸（英文名：L-tyrosine，也可以简称L-tyr）是构成蛋白质、多肽的常规普通氨基酸中的一种，是芳香环族、非必须类型的氨基酸。L-酪氨酸的外形一般都是白色或类似白色结晶性粉末状固体，它的味道稍显苦味，在常温以及常压下微溶于水，基本上都是难溶或不溶于无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂，但在一定的pH值下，可以溶解于氢氧化钠碱溶液或者无机酸溶液（盐酸等）。

结构式，见图1-1：

图1-1 L-酪氨酸结构式

L-酪氨酸的应用

在医药领域，L-酪氨酸是制备很多药物的前体原材料^[1,2]，例如，临床上，用于治疗帕金森疾病的高效药——多巴胺，就是由左旋多巴在体内转变而成，而后者就是通过L-酪氨酸制备的。另外，有着苯丙酮尿症的患者在医院里接受治疗所必须的一种氨基酸就是L-酪氨酸^[3]。

在饲料产业^[4]，L-酪氨酸可作为饲料添加剂，添加于雏禽的饲料中，防止幼禽体内缺乏酪氨酸，减少甲状腺激素等物质的合成，进而引起体重的下降。

在化工方面^[5]，L-酪氨酸是一种应用广泛的化学试剂，比如腐蚀抑制剂、碱水解催化剂等；L-酪氨酸的衍生物在手性化学制备中还有着一定的作用，可用作一些特殊结构的化学拆分剂。

L-酪氨酸生产的发展现状

当前在国内外一般有许多种方法来制备或生产L-酪氨酸，大约可以由以下四种方式生产：从天然的生物或者生化原料中提取、直接从糖类原料发酵而来、利用底物酶转化以及化学合成继续拆分法。另外，传统上还会使用蛋白质水解法来制备L-酪氨酸，但是此法缺陷较多，反应的原材料有限、反应不够彻底^[6]、工艺复杂、产物成分多，因此现在不常用。目前最新兴的方法之一是利用代谢工程来改造生物体内的代谢途径，虽然取得了一定的效果，但是该法耗时耗力，影响因素众多，工程菌的构建难度较大，所以也还未广泛应用。另外，将化学法与酶法相结合的生产方法日渐成熟，应用较广，发挥了两者的优势，提高了产量。但是，目前国内L-酪氨酸生产企业少批量生产，其产品质量和制造成本都缺乏与国外大公司竞争的能力。随着L-酪氨酸的消费量日益增加，市场需求正日益扩大，改进合成工艺以降低成本，提高产品质量显得越来越紧迫。因此，探索制备 L-酪氨酸的较低成本、较高产率途径意义重大，无论在经济效益上还是社会影响力上都具有良好的作用。

L-酪氨酸的制备

在生物体内，L-苯丙氨酸经过羟基化可以生成L-酪氨酸，另外，也可以经过分支酸和对羟苯丙氨酸的相关途径获得，但是在人体内与在植物、动物体内的合成过程不同。目前，以大肠杆菌（Escherichia coli，从动物体内来)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum，从非动物体内来)中的L-酪氨酸基础的及其衍生发展的生物代谢环境机制研究得最为详细^[7,8]。采用新兴的代谢工程^[9]，就可以经过优化代谢途径来改善天然生物合成L-酪氨酸产量低的缺陷，获得一定的成效。

提取法

提取法是通过对含有天然蛋白质、多肽的资源（多肽中含L-酪氨酸），用高温或者高压水解、去除多余水分杂质、降温结晶、脱色去杂等许多操作起来比较麻烦和消耗巨大体力劳动的步骤来分离其它氨基酸得到L-酪氨酸。这种生产工艺所提取获得的L-酪氨酸一般品质都比较低，还需要进一步纯化处理，所以这个方法收率不高。

直接发酵法

直接发酵法^[10,11]是利用合适的菌种（短杆菌、棒杆菌），对其进行诱变处理后，经发酵过程制备L-酪氨酸。除了利用诱变来获得高活力菌株，还能通过基因重组的方法来改良菌株，相关的研究也已经不断得被报道出来了。

酶转化法

Yamada和Kumagai两位科学家第一次证实了L-酪氨酸的酶法制备^[12]。

一类为，见图1-2：

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