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摘 要

UDP-葡萄糖脱氢酶（UDP-GlcDH）是透明质酸合成过程中关键的限速酶，可以将UDP-葡萄糖催化生成透明质酸必需的前体物质UDP-葡萄糖醛酸。采用大肠杆菌BL21（DE3）的基因组DNA为模板，通过PCR获得BL21（DE3）的UDP-GlcDH基因ugd，并采用分子生物学方法将菌株的ugd基因插入表达载体pET22b中，获得重组质粒pET22b-UGD-R，再将其转化于DH5ɑ中涂布于氨苄平板上；采用IPTG诱导表达UDP-GlcDH，并测定UDP-GlcDH的活性，探索出IPTG诱导条件下UDP-GlcDH的表达量及活性差异。并采用亲和层析对酶进行纯化，通过SDS-PAGE电泳图对比纯化前与纯化后的结果。

关键词：透明质酸 UDP-葡萄糖脱氢酶启动子 基因测序 亲和层析

ABSTACT

UDP-glucose dehydrogenase, as the key rate-limiting enzyme in the hyaluronic acid synthesis process, can catalyze UDP-glucose to UDP-glucuronic acid which is essential for cell to produce hyaluronic acid. The ugd gene amplified from genomic DNA of Escherichia coli BL21（DE3）by PCR were cloned into pET22b vector containing PL promoter. The plasmi pBLBugd and pBLYugd were constructed and transformed respectively into Escherichia coli BL21（DE3） to get four recombinant strains. UDP-glucose dehydrogenase activity of different recombinant strains was measured by thermal induction. The differences of expression level and enzyme activity of UDP-glucose dehydrogenase were detected under different temperature induced conditions. These result demonstrate that adopting double stage of heating induction and adding some moderate amount of yeast extract to the cultivating medium can improve the expression level and enzyme activity of UDP - glucose dehydrogenase.

Key words: Hyaluronic acid ; UDP-glucose dehydrogenase ; PL promoter ; Gene sequencing affinity chromatography

缩词列表

目录

摘要 I

ABSTACT II

目录 IV

第一章引言 1

1.1 研究意义 1

1.2 研究背景 1

1.2.1 葡萄糖脱氢酶的酶学研究 1

1.2.2 UDP-葡萄糖脱氢酶代谢机制及生物学功能 1

1.2.3 UGDH基因的特性研究 2

第二章UDP-葡萄糖脱氢酶的克隆和表达 4

2.1 材料与方法 4

2.1.1 材料 4

2.1.2 方法 7

2.2 结果 11

2.2.1 UDP-葡萄糖脱氢酶基因ugd的扩增及重组质粒的验证 11

2.2.2 ugd基因序列的测定与序列比对 13

2.2.3 ugd基因在大肠杆菌中的表达 17

2.2.4 酶活测定 17

第三章 UDP-葡萄糖脱氢酶的纯化 18

3.1 材料 18

3.1.1 材料及试剂 18

3.1.2 培养基及缓冲液 18

3.2 酶活测定 18

3.3 方法 18

3.3.1 菌体的大量培养 18

3.3.2 重组酶的纯化 18

3.3.3 重组UGDH性质的研究 19

3.4 结果与讨论 20

3.4.1 UGDH的纯化结果 20

第四章结论与展望 21

4.1 讨论 21

4.2 本文工作的不足及展望 21

参考文献 23

致谢 25

第一章 引言

1.1 研究意义

UDP-葡萄糖脱氢酶（UDP-GlcDH）在常见于动物、植物与细菌中，它生物催化UDP-葡萄糖转化形成UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），而UDP-GlcA是构成结构多糖和细胞生长代谢必不缺少的前体物质。相关研究结果证明UDP-GlcDH有助透明质酸（HA）的生成，活性越高效果越好。PL启动子受噬菌体CI基因的调控，CI基因温度敏感性突变体所产生的CI857阻遏蛋白在低温30℃时候具有阻遏作用，在温度高于37℃时候阻遏蛋白失活并且阻遏解除，促使PL启动子转录。本实验室对大肠杆菌BL21（DE3）进行ugd基因克隆，重组链接于表达载体pET22b上，将重组质粒转化到BL21（DE3）中采用IPTG诱导表达，考察不同含量IPTG对UDP-GlcDH的酶活影响，并通过亲和层析纯化旨在为后续利用大肠杆菌的表达系统表达来自链球菌的hasA基因以及超表达大肠杆菌ugd基因，并最终合成HA奠定基础。

1.2 研究背景

1.2.1 葡萄糖脱氢酶的酶学性质研究

1975年，葡萄糖脱氢酶率先被Pauly和Pfleiderer从B.megaterium中纯化，其比活为550U/mg，通过凝胶渗透色谱测得该酶活性形式的分子量为116kDa，由4个多肤链组成该酶的活性形式。在Tris-HCI缓冲液中最适pH为8.0，而在醋酸盐/硼酸盐缓冲液中则为9.0。当pH=9.0时，Km(NAn )=4.5mM，Km(葡萄糖)=47.5mM。D-葡萄糖脱氢酶能以NAD 和NADP 为辅酶，对D-葡萄糖具有高度特异性。琉基抑制该酶活性，重金属离子和鳌合剂对其无抑制作用。

Boontim等从B.thuringiensis M15得到了D-葡萄糖脱氢酶，纯化后的酶SDS-PAGE显示其分子量为25kDa，最适pH是8.0，在pH6.0至5.0稳定，在pH7.0最稳定。化学试剂EDTA，pCMP，DEP，PGO，pMSF，1.10菲罗琳，二异丙基氟磷酸，DTT，均抑制酶活，而EDTA是最有效的抑制剂。

1.2.2 UDP-葡萄糖脱氢酶代谢机制及生物学功能

糖类是广泛存在于自然界中的一类重要的有机化合物，它是维持生命活动所需能量的主要来源，在生命活动中发挥着极为重要的作用。

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