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摘 要

为了获得碱性蛋白酶细菌，从所采取的海水中经过初筛、复筛得到具有一定产碱性蛋白酶能力的菌株。首先，通过分离纯化培养基从海水中挑出能够生长的菌种。然后，将已经分离纯化的菌株用点种法接入脱脂牛奶琼脂平板培养基，得到能明显水解脱脂牛奶产生水解圈的菌株。测定菌落直径（D）与水解圈直径（d），比较d/D的比值，比值越大，菌株产酶能力越大，挑选出好的菌株保存在牛肉膏蛋白胨试管斜面上。最后，采用Folin-酚法通过测定发酵液酶活力进行复筛。Folin-酚和标准酪氨酸溶液反应，在OD₆₈₀下制作标准曲线。将初筛得到的株菌接入pH值为8.5的发酵培养基中，20mL发酵液/50mL 三角瓶、37 ℃、160 r/min振荡培养24h，得培养液，离心去除菌体，用Folin-酚法测定上清液的酶活力。通过酶活力的比较，得到实验想要的菌株。

关键词：碱性蛋白酶 水解圈 酶活力 标准曲线 Folin-酚

窗体底端

Screening of bacteria from seawater alkaline protease

Abstract

In order to obtain an alkaline protease bacteria taken from seawater through the screening, the rescreening get a certain production capacity of alkaline protease strain. First, by separating medium pick from seawater bacteria can grow.Then, a strain that has been isolated and purified access skim milk agar plate medium by the check point method to obtain a strain that can significantly hydrolyzed skim milk producing hydrolysis circle. Determination of colony diameter (D) and hydrolysis circle diameter (d), comparing the ratio d / D, the larger ratio, the greater the strain of enzyme production capacity, and then pick out the good strains stored on beef extract peptone slant tubes. Finally, the use of phenol Folin- rescreening method of enzyme activity by measuring the fermentation broth. The strain obtained using the standard curve Folin-phenol at OD680. The strains obtained by screening a pH of 8.5 to access the fermentation medium, 20mL broth / 50mL flask, 37 ℃, 160 r / min shaking 24 h, the culture medium was removed by centrifugation cells with Folin - Determination of the supernatant phenol method of enzyme activity. By comparing the enzyme activity, to get the desired experimental strains.

Keyword：Alkaline protease ; Hydrolytic ring ; Enzyme activity ; The standard curve; Folin-phenol

目录

摘要： I

ABSTRACT I

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1碱性蛋白酶的背景 1

1.2碱性蛋白酶的性质 1

1.2.1分子量 1

1.2.2最适pH和pH稳定性 1

1.2.3最适温度和热稳定性 2

1.2.4金属离子对酶活性的影响 2

1.2.5底物特异性 2

1.3碱性蛋白酶的应用 3

1.3.1食品，饲料，洗涤剂 3

1.3.2皮革 3

1.3.3其他 3

1.4微生物碱性蛋白酶的研究现状 3

1.4.1微生物碱性蛋白酶产酶菌种 3

1.4.2国外研究现状 3

1.4.3国内研究现状 4

1.5碱性蛋白酶研究的技术进展 5

1.5.1微生物细胞的诱变技术 (传统法) 5

1.5.2 微生物的原生质体技术 5

1.5.3 DNA体外重组技术—基因工程 5

1.5.4蛋白质工程 6

1.5.5抱子热处理 6

1.6从海洋中提取产碱性蛋白酶菌株的原因 6

第二章 海水中产碱性蛋白酶细菌的筛选 8

2.1实验材料和仪器 8

2.1.1实验材料 8

2.1.2实验仪器 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 取样 9

2.2.2 菌株的分离纯化 10

2.2.3 产碱性蛋白酶细菌的初筛 11

2.2.4 菌株的保存 11

2.2.5 产碱性蛋白酶细菌的复筛 12

第三章 实验结果与讨论 14

3.1初选结果 15

3.2 碱性蛋白酶产生菌的复筛 16

3.2.1标准曲线的制作 16

3.2.2产酶菌株的复筛 16

第四章 结论与展望 18

4.1结论 18

4.2展望 18

参考文献 20

致谢 23

1. 文献综述

1.1 碱性蛋白酶的背景

碱性蛋白酶（Alkaline Protease）是一类在pH值碱性范围内，能够水解蛋白质肽键的酶，最早发现在猪的胰脏中，1913年Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用^[1]。1945年瑞士的Dr.Jaag 等人在地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）发现了微生物碱性蛋白酶^[2]，并且使蛋白酶广泛用于洗涤剂工业中；其次，在碱性蛋白酶在食品、制革等行业中也有着十分广泛的用途。目前，全世界工业酶每年的销售额已不止1亿美元，且所有的工业酶制剂中75%是蛋白水解酶，蛋白酶是工业酶中使用比例最大的酶类，大约占全世界每年销售量的60%^[3]。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物来源的蛋白酶相比，具有下游技术处理相对简单、价格较低廉、来源广、菌体易培养、产量高，高产菌株选育相对简单，快速，具有动植物蛋白酶全部特性，另外，易于实现工业化大批量生产。产碱性蛋白酶菌株用于研究和应用较多的是芽孢杆菌，以枯草杆菌为最多，也有少量其他菌种，比如链霉菌。相比中性蛋白酶，碱性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，较大的耐热性和一定的酯酶活力。因此，碱性蛋白酶的研究成为了蛋白酶研究的热点。

1.2 碱性蛋白酶的性质

1.2.1 分子量

碱性蛋白酶的分子量范围一般在18~35KDa，少数碱性蛋白酶的分子量例外，达到45 KDa或82KDa^[4]，诚然也有少数蛋白酶分子量很小，甚至只有8KDa。在某些芽孢杆菌中，碱性蛋白酶的电泳条带呈现多样性。而造成这种多样性的原因有两方面，其一是酶蛋白分子中的天冬酰胺或谷氨酰胺残基的可逆脱氨基作用，另一方面是一些蛋白酶的自我剪切作用。

1.2.2 最适pH和pH稳定性

蛋白酶是能够在一定的温度和pH条件下，催化蛋白质水解成小肽和氨基酸的一类生物酶。酶的活性受环境pH的影响显著。通常酶只有在一定的pH范围内才能表现出活性。酶表现其催化活性最高时的pH值就是该酶的最适pH，低于或高于最适pH值时，酶的活性会逐渐降低，不同酶的最适pH值不同。在碱性条件下，碱性蛋白酶可以水解蛋白质肽

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