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摘 要

富马酸(Fumaric acid)，又称延胡索酸，是一种重要的四碳平台化合物。市场上所售的富马酸主要通过石化法获得，随着石油资源的不断消耗和石油价格的持续波动，以及化学法制备过程所产生的环境污染等原因，富马酸产业的可持续发展面临严峻的挑战。微生物发酵法生产富马酸由于原料可再生，过程温和，环境污染小而越来越受到人们的关注。

针对富马酸天然生产菌株米根霉具有发酵时间长、形态难控制等问题，本研究拟采用培养条件简单、遗传背景清晰的大肠杆菌作为生产菌株。但原始的大肠杆菌虽然具有富马酸的代谢途径，一般不积累富马酸，要提高其产富马酸的能力，需对现有菌株进行基因改造。由于多基因的敲除会给菌体造成代谢负担，故选择高效的基因手段是极其重要的。本实验在已敲除富马酸酶AB（fumAB）基因基础上，继续敲除富马酸还原酶ABCD(frdABCD)基因及引入高效的small RNAs(sRNAs)技术，同时实现靶基因（poxB、mgsA、及pta）沉默，从而提高富马酸产量。

关键词：富马酸 大肠杆菌 基因敲除 sRNA

Genetically engineered bacteria construction for fumaric acid production

Abstract

Fumaric acid is a four-carbon dicarboxylic acid.Fumarate sold on the market,mainly get through petrochemical methods.Along with the continue to consume of oil resources and the volatility of the oil prices, as well as chemical method processes environmental pollution. The sustainable development of fumaric acid industry is facing challenge.Fermentat.More attention is paid to fermentation producting fumaric acid for it’s renewable raw materials, process moderate and less pollution.

Rhizopus species showed to be the best producer of fumaric acid., but it always takes much time for fermentation, and difficult to control the morphology. E. coli with a simple, clear genetic background, easy to be control, and thought to be the most promising strain for most of organic acids production.Because morem etabolic burden will be caused by multiple gene knockout, it is extremely important to choose an efficient gene means.This experiment is based on the knockout fumarase AB (fumAB) gene,and continu knockout fumarate reductase ABCD (frdABCD) gene and intoduced the efficient small RNAs (sRNAs) technology,while achieving the target gene (poxB,mgsA and pta) silence , thereby improving the yield of fumaric acid.

Keywords:fumaric acid ;E. Coli ;genetic knockout;sRNA

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 富马酸的结构及理化性质 1

1.2 富马酸应用 2

1.3 基因工程菌产富马酸的研究进展 3

1.3.1 混合酸途径 3

1.3.2 三羧酸循环途径 3

1.4 细菌sRNA简介 4

1.4.1 sRNA的类型 4

1.4.2 大肠杆菌中sRNA的功能 4

第二章 实验仪器、材料及实验方法 6

2.1 实验仪器 6

2.2 实验材料 6

2.2.1 质粒与菌种 6

2.2.2 培养基配方 6

2.2.3 培养条件 7

2.3 实验方法 7

2.3.1 red重组敲除基因方法总述 7

2.3.2 引物设计 7

2.3.3 聚合酶链式反应（PCR） 8

2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 9

2.3.5 大肠杆菌MG1655感受态细胞制备方法 10

2.3.6 外源DNA和质粒的导入及转化方法 10

2.3.7 胶回收 11

2.3.8 质粒快检 12

2.3.9 进行耗氧发酵培养 12

2.3.10 有机酸产量检测方法 12

第三章 实验结果与讨论 13

3.1敲除富马酸还原酶ABCD对大肠杆菌产富马酸的影响 13

3.1.1 氯霉素抗性PCR片段的制备 13

3.1.2 基因frdABCD敲除菌株的鉴定 14

3.2 单个sRNAS导入菌株的鉴定 15

3.3 发酵结果分析 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 16

4.2 展望 16

参考文献 18

致 谢 19

第一章 文献综述

1.1 富马酸的结构及理化性质

富马酸（fumaric acid），又称反丁烯二酸、延胡索酸，是一种不饱和四碳二元羧酸，分子式为C₄H₄O₄，分子量为116.07，其结构如图1-1所示。

富马酸在常温常压下为白色结晶粉末，有酸味，其密度为1.625kg/m³，熔点为286℃，在290℃时会发生分解。富马酸稍溶于冷水，较易溶于热水，溶于乙醇，微溶于丙酮，难溶于乙醚、四氯化碳、氯仿等，不溶于苯。富马酸在不同温度下于水中的溶解度如表1-1所示，可以看出其溶解度随着温度的升高而增大。同时，不同的富马酸盐也具有不同的溶解度（见表1-2），富马酸钠易溶于水，富马酸钙难溶于水。富马酸在水中的解离常数为：PK₁=3.02，PK₂=4.38，PKI=3.70。[1-2]

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