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摘 要

体外DNA重组技术是于一九七二年首先在大肠杆菌中获得成功的，之后相应的开始研究别的微生物，生产出了多种新型发酵产品。自从Dr. Kary B. Mullis于1983年发明PCR以来，科学家对基因的克隆与重组的研究更是一日千里。随着功能基因组研究的需要，新近建立起一项新型高效的基于体内同源重组的遗传工程技术-重组工程技术。重组工程可定义为：基于噬菌体短同源序列重组功能的遗传工程,或者基于同源重组的遗传工程。λ噬菌体Red系统完全不同于传统的依赖RecA的大肠杆菌重组系统，特点是使用长度仅为lt;50个碱基的同源臂高效率地催化体内同源重组反应。本论文主要研究如何合成一段已知序列的DNA，将其连接进入载体puc57，并转化进大肠杆菌获得大量克隆以及影响连接转化效率的因素。

关键词：PCR重组 转化 酶切 连接

The cloning and recombinant of target gene

Abstract

In vitro recombinant DNA technology had been successful in the E. coli in 1972, and extended to other microorganism to produce a variety of new fermented products. Since Dr. Kary B. Mull invented PCR in 1983, scientists have received more success in the cloning and recombinant of target gene. Driven by the need of functional genomics, a homologous recombination-based, highly efficient genetic engineering system that termed “recombineering” has recently been developed. Recombineering has been defined as a genetic engineering with phage-encoded recombination function that utilizes short homologies, a convenient term to describe homologous-dependent, recombination-mediated, genetic engineering. The bacteriophage λ Red recombination system has critical differences from standard E .coli RecA-dependent recombination pathway. The phage systems have unique advantage in that they can catalyze efficient recombination with very short regions of sequence homology（lt;50 bp）. This paper studies in how to synthesize a section of known sequence of DNA and how to connect it into the vector puc57 and transform into E. coli to get some cloning. The paper also explore the factors that influence the conversion efficiency of connection.

Key words: PCR; Recombinant; Transformation; Digestion; Link

目 录

摘要 I

Abstract II

前言 1

第一章 材料与方法 2

1.1实验材料 2

1.1.1需要合成的基因序列： 2

1.1.2实验器材 3

1.1.3试剂准备 3

1.1.4菌种、质粒 3

1.2实验方法 3

1.2.1 目的基因片段设计 3

1.2.2 PCR反应体系及扩增 5

1.2.3 目的基因与载体的连接及转化 8

1.2.4 阳性单克隆筛选 10

第二章 结果与分析 13

2.1引物分段并进行PCR扩增的结果 13

2.1.1第二轮PCR产物检测图 13

2.1.2第三轮PCR产物检测图 13

2.1.3 PCR结果分析 14

2.2 目的基因与载体的连接及转化结果分析 15

2.3 阳性单克隆筛选结果分析 15

第三章讨论 17

3.1 PCR扩增 17

3.2目的基因与载体的连接及转化 17

3.3阳性单克隆筛选 17

致谢 18

参考文献 19

前 言

生物的遗传和性状是由基因决定的，基因在生物学中的作用和意义是非常之大的，在化学的角度来说，基因就是一段有这生物功能的能够合成蛋白等生物物资的特定的DNA顺序。在一九六五年时，由Holley首次说明了酵母丙氨酸tRNA的化学结构，其结构中有这氨基和羧基。在此不久，Khrorana由此成果研究出可能的基因的构造，并开始合成酵母丙氨酸tRNA的基因序列。在一九七二年，第一次在大肠杆菌中成功的完成体外的DNA重组技术，然后别的一些微生物相继研究中。科学家对基因组重组与克隆的探索越来越多是在一九八三年Dr. Kary B. Mullis成功研发PCR之后。

基因工程技术^[1]诞生至今取得了巨大的成就，成为现如今生命科学研究方面最引人注目和最有生命力的前沿学科之一，基因工程同时是新的产业革命的一个非常重要组成部分。

生物体是由细胞组成，细胞中含有细胞核，细胞核中含有染色体，染色体是由蛋白质和DNA残绕组成的。DNA中的碱基看似没有规律可循，然而遗传讯息是由他们的排列循序决定的。三个碱基对应一个密码子，三个碱基的排列组合对应着六十四中排法，相应的有20种氨基酸。根据密码子的顺序决定着氨基酸的顺序，从而决定蛋白质的性状，调控基因的表达部分取决于基因中的启动控制区。

现在只提供一段序列，就可以将想要的目的序列给扩展出来，本实验主要运用的是重叠延伸PCR法^[2]。重叠延伸PCR利用引物末端互补的原理,这样PCR扩增出来的产物就会带有重叠部分,之后将重叠部分进行延伸 ,这样就能将不同的来源片段连接起来。

重叠延伸PCR法不需要连接酶和限制性内切酶，是因为其采用PCR技术在细胞外面可以得到成功的体外重组,这样的话，那些依靠限制性内切酶却很难克隆出来的，利用重叠延伸PCR法就可以很好的解决。对于较稀有的酶，节约了很多成本。

重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。具体的操作细节和原理可以参考Lei Young和Qihan Dong的两步发基因合成^[3]文章。

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