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摘 要

蔗糖磷酸化酶 (EC2.4.1.7,Sucrose Phosphorylase，Spase)是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。该酶对供体具有专一性，而对受体无严格的专一性，糖基供体分为两种：一磷酸葡萄糖和蔗糖，主要催化2种类型的反应：一是将一磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体，如以D-果糖为受体，在该酶催化下可生成相应的二糖；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质，如以磷酸为受体 ，可生成1-磷酸葡萄糖。

本实验通过重组大肠杆菌发酵生产重组蔗糖磷酸化酶，以重组蔗糖磷酸化酶催化蔗糖的葡萄糖基转移反应，反应受体为甘油，产物为甘油基葡糖苷。甘油基葡萄糖苷是一种天然糖苷，广泛运用做食品，化妆品等轻工业添加剂。实验通过对酶学性质的研究，测定酶活力，了解其对转化的影响。通过改变单一的实验条件，测定温度，pH，底物浓度，转化时间对转化率的影响。最终测定在最优条件下，甘油的转化率能够达到95% 左右。

关键词：发酵 蔗糖磷酸化酶 甘油基葡糖苷

Sucrose phosphorylase producing recombinant E. coli transformed polyol glucoside research

ABSTRACT

Sucrose phosphorylase (EC2.4.1.7, Sucrose Phosphorylase, Spase) catalyzes the transfer of a specific enzyme glucoside bond . The enzyme having specificity for , and no strict receptor specificity, two types of glycosyl donor : sucrose, glucose and phosphate , which catalyses the reaction of two types : one is a glucose phosphate the glucosyl transfer to the acceptor , such as the receptor D- fructose , disaccharides may be generated at the corresponding enzyme catalysis ; Second glucosyl sucrose is transferred to the receptor, including the inorganic phosphate , water , phenolic hydroxyl , alcoholic hydroxyl group and a carboxyl group , such as a phosphoric acid acceptor , to generate glucose 1 - phosphate .

  The experimental fermentation by recombinant Escherichia coli to produce recombinant sucrose phosphorylase , recombinant sucrose phosphorylase sucrose glycosyltransferase catalyzed reaction , the reaction of glycerol receptor , the product is glyceryl glucoside . Glyceryl glucoside is a natural glycoside , widely used as food , cosmetics and other light industrial additives. Experimental study of enzymatic properties by measuring enzyme activity , understand its impact on conversions. By changing the experimental conditions, a single measurement temperature , pH, substrate concentration , the conversion time on the conversion rate . In the final determination of the optimum conditions , the conversion of glycerol to reach about 95% .

     Keywords : fermentation Sucrose phosphorylase Glyceryl glucoside

目录

摘要 I

ABSTRACT II

1.1 葡糖苷的简介 1

1.1.1多元醇葡糖苷的合成 2

1.1.2 多元醇葡糖苷的应用 2

1.1.3 多元醇葡糖苷的研究现状 2

1.2 酶法生产 3

1.2.1 蔗糖磷酸化酶的简介 3

1.2.2蔗糖磷酸化酶的生产菌株及制备过程 4

1.2.3 蔗糖磷酸化酶的结构与催化特征 5

1.3 使用蔗糖磷酸化酶生产多元醇葡糖苷目前的现状 7

1.4 使用蔗糖磷酸化酶转化葡糖苷的意义 8

1.5 本实验的具体内容 8

2.1 实验材料和仪器 9

2.1.1 实验材料 9

2.1.2 实验仪器 10

2.2 试验方法 11

2.2.1 培养基与发酵产酶 11

2.2.2 粗酶提取及酶活测定 11

2.2.3 转化条件 12

2.2.4色谱条件 13

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 pH和温度对酶活力和稳定性的影响 14

3.2 蔗糖磷酸化酶及实验测定的一些参数 16

3.3 蔗糖磷酸化酶转化多元醇葡糖苷 16

3.3.1 粗转化 16

第四章 总结与展望 21

4.1 总结 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 葡糖苷的简介

多元醇葡糖苷^[1]是一类由乙二醇、甘油及聚乙二醇等多元醇和葡萄糖经缩醛化脱水缩合而成的糖苷类化合物，是制备糖苷类表面活性剂和餐具洗涤剂的重要原料，也可以作为保湿剂和保鲜剂应用于化妆品和水果保鲜领域。

20世纪60年代中期，美国农业部北方农业研究中心Otey^[2]最早利用淀粉与乙二醇进行糖基转移反应研究了这种多羟基化合物的合成。20世纪90年代，金征宇^[3-6]等在国内最早采用挤压机作反应器研究了该转糖基反应。初步结果表明淀粉与多元醇进行转糖基反应具有转化容易、成本低、理论产率高(理论上无质量损失)等优点。转化产物不含半缩醛羟基，不具还原性，对酸、碱及氧化剂具有比原来的还原糖高得多的稳定性，可以经受酸、 碱催化剂以及较高的温度、压力下的化学加工。这类由淀粉生产的多羟基化合物可以应用于制备聚醚、聚氨酯塑料、醇酸树脂油漆、生物可降解表面活性剂以及化妆品保湿剂等诸多领域。

甘油基葡糖苷^[3]是一种天然糖苷，自然存在的都是α-D-葡糖基-α-（1,2）-甘油（简称α-GG），也有少部分葡糖基-α-（1,1）-甘油结构存在，它的分子结构如下图所示：

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