论文总字数：20280字

摘 要

脂肪酶是一类重要的生物催化剂，因其具有反应选择性高、条件温和、不需要辅酶、环境友好等特点，被广泛应用于有机合成中。Aldol缩合反应(即羟醛缩合反应)是有机化学中形成C-C键的关键反应之一，是公认的一种用于新的碳碳键的形成最强大的方法，因其反应生成的产物大多是有机合成的重要中间体而备受人们关注。

本文采用脂肪酶作为催化剂催化Aldol缩合反应，对比了不同来源的脂肪酶对Aldol反应的影响，选择其中催化效果较好的脂肪酶LPL进行工艺条件优化。为了提高转化效率，我们选择加入添加剂的方式来改善酶的催化效果，对比了5种添加剂对反应的影响，得到了与LPL具有显著的协调催化作用的添加剂——咪唑。在此基础上考察了添加剂的使用量、水含量、酶浓度、反应时间以及底物结构对酶催化Aldol缩合反应的影响，最终得到最佳工艺条件：水含量为30%，添加剂咪唑为60 mol%，催化剂LPL用量为0.2 g，在此条件下在35℃反应48 h，吸电子取代的芳香醛与丙酮的Aldol缩合反应收率为60.1-92.7%。

关键词：脂肪酶；咪唑；Aldol缩合

Abstract

Lipase is a kind of important biological catalyst because of its high selectivity, mild condition, no need of coenzyme and environment friendly, and is widely used in organic synthesis. Aldol condensation reaction (i.e. aldol reaction) is recognized as a most powerful method in the carbon carbon bond forming reactions in organic chemistry, because the reaction products are important intermediates in the organic synthesis which has attracted much attention.

In this paper, lipase was used as catalyst for Aldol condensation reaction and effects of different sources of lipases were compared in response to Aldol, finally the lipase of LPL was chosen to do the following process optimization. In order to improve the transformation efficiency, we added additives to improve the catalytic effect of enzyme. Taking five kinds of additives into consideration, the additive iminazole had the most significant co-catalytic effect with LPL. This biocatalysis is applicable to the aldol reactions, with a wide range of aromatic aldehydes bearing an electron-withdrawing substituent to aliphatic ketones and cyclic ketones when the reaction was conducted at 35℃ for 48 h under 30% water content and 60 mol% imidazole, lipase 0.2 g, with the yields up to 60.1-92.5%.

Keywords: lipase; imidazole; aldol reaction

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 脂肪酶的概述 1

1.1.1 脂肪酶的结构特征 1

1.2 脂肪酶在非水相酶学中的应用 2

1.3 脂肪酶催化Aldol缩合反应 3

1.3.1 Aldol缩合反应的研究前景 3

1.3.2 脂肪酶催化Aldol缩合反应的研究现状 3

1.4 Aldol缩合反应中添加剂对脂肪酶的调控作用 4

第二章 实验仪器和材料 6

2.1 实验仪器 6

第三章 实验方法与结论 9

3.1 实验方法 9

3.2 结果与讨论 9

3.2.1不同来源酶对反应的影响 9

3.2.2 不同添加剂对反应的影响 10

3.2.3 咪唑添加量对反应的影响 11

3.2.4 水含量对反应的影响 12

3.2.5 重复使用性的考察 13

3.2.6 反应底物的普适性研究 13

第四章 结论与展望 16

4.1 结论 16

4.2 展望 17

参考文献 18

本科期间所获成果 22

致谢 23

第一章 文献综述

1.1 脂肪酶的概述

脂肪酶( lipase E. C. 3. 1. 1. 3) 又称酰基甘油水解酶( acylglycerol hydrolases) 广泛存在于原核生物(如细菌) 和真核生物(如动物、植物、霉菌等) 中。脂肪酶是最早的发现的酶之一，早在1834 年就发现了脂肪酶至今已有一百多年的历史。脂肪酶以其高选择性、高稳定性、反应条件温和，不需要辅酶等优良特性而成为一种重要的、应用广泛的工业用酶，除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性， 催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成成为酶工程领域研究的新热点。因此，脂肪酶制剂被广泛应用于医药、化工、食品、饲料和能源等行业，是当前应用最广泛的生物催化剂之一^[1-3]。

目前，全世界脂肪酶制剂市场份额已经超过1亿美元，支撑着下游数十倍甚至数百倍的工业产值，例如其中应用前景最广阔的产品手性药物全球市场销售额高达五百多亿美元。在生物催化转化研究中有30%左右都涉及到脂肪酶，因此脂肪酶是当前的研究热点。

1.1.1 脂肪酶的结构特征

脂肪酶分子由疏水、亲水两部分组成，其活性中心靠近疏水端。不同来源的脂肪酶具有不同的氨基酸组成(氨基酸序列、数目、及三维空间结构等)，但由于生物的同源性和进化过程的保守性，其催化中心具有相似的特征区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（X、Y、Z、W为可变的氨基酸残基）^[4-5]。大多数脂肪酶的活性中心是由丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）构成的催化三联体^[6-7]，其中丝氨酸残基和天冬氨酸残基都通过氢键与组氨酸连接。在反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。通常情况下，脂肪酶活性中心完全埋藏在一个“盖子”状结构下面^[8]，“盖子”结构由一个或两个α-螺旋构成。只有在脂肪酶的盖子结构打开之后底物才能进入其催化活性中心完成催化过程。在底物存在的情况下，通过亲电子域作用使脂肪酶构象改变，“盖子”打开，暴露出活性中心从而使底物进入，脂肪酶提供电子对发生催化反应。

1.2 脂肪酶在非水相酶学中的应用

传统的观念认为脂肪酶只能在水相中才具有催化活性，然而，在1984年美国科学家Zaks和Klibanov^[9-10]次发现脂肪酶在含有一定水量的有机溶剂中仍然具有催化活性，这一开创性研究奠定了非水相酶学的基础，使得酶促合成在有机反应中有了长足的发展，也开拓了生物酶广阔的应用前景。非水相酶催化指的是酶在含有一定水量的有机溶剂中进行的催化反应。

酶在有机介质中进行酶促反应时，不仅表现出在水相中酶的催化优点，还表现出以下优点^[11-13]：（1）在水相中难以溶解的疏水性底物可以在有机溶剂中很好的溶解；（2）在有机介质中可以抑制由水诱导的副反应发生；（3）产物回收容易，低沸点有机溶剂作为反应介质时容易通过减压蒸馏等方法除去，而水难以除去；（4）酶容易回收重复利用，因为酶不溶于有机溶剂，在有机介质中反应时是一个固-液两相的悬浮系统；（5）酶在有机溶剂中能够保持刚性结构，构象比在水相中稳定，所以在有机溶剂中酶的热稳定性要比在水相中高；（6）可以减少底物或产物对酶的抑制；（7）无杂菌污染；（8）易控制底物专一性等。因此，有机相酶催化作用的研究已成为涉及生物化学、有机化学、高分子化学、生物工程、酶工程等多学科交叉研究的热点。

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