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摘 要

近年来，随着化石能源的日以消耗以及全球气候的恶化，生物质能源是一个具有发展潜力的可替代能源，而丁醇作为第二代生物质能源，具有广泛的用途，是最具有商业前景的产品。但是丁醇在发酵培养基内积累所产生的毒性问题是限制丁醇产量的重要因素，因此如何提高菌种的丁醇耐受性成为一个主要问题。

本文通过序列对比，找到拜氏梭菌中的编码疑似蛋白基因Cbei_3255，通过对该基因二型内含子插入失活，获得Cbei_3255基因插入失活的重组菌株。通过此方法得到的菌株接种在丁醇浓度为18 mL/L的种子培养基中还可以微弱生长，而出发菌株在丁醇浓度为14mL/L的种子培养基中便基本停止生长。通过转接发现，将Cbei_3255基因插入失活的拜氏梭菌缺陷株经过5次转接后发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，各代菌株均能够在18mL/L的种子培养基中生长，重组菌株具有良好的遗传稳定性。

关键字：拜氏梭菌 丁醇 丁醇抗逆性 ABE发酵

A search on Clostridium beijerinckii to improve the resistance of the high concentration of butanol in ABE fermertation

Abstract

In recent years, as the date of fossil energy consumption and deterioration of global climate, biomass alternative energy source is a potential for development, the butanol as the second generation of biomass energy, with a wide range of uses, is the most commercially promising products. But the problem of toxicity in the accumulation of alcohol in a fermentation medium which is an important limiting factor to produce butanol yield, therefore, how to improve the species butanol tolerance becomes a major problem.

Through sequence alignment , we find Clostridium beijerinckii encoding gene Cbei_3255 suspected, through the insertion of the gene two introns inactivation, to obtain the recombinant strain with the gene Cbei_3255 insertional inactivation. The recombinant strain in the alcohol concentration of 18mL/L seed culture medium can also be weak growth, but the starting strain in the butanol concentration of 14mL/L seed medium will stop growing. By adapter found, after fifth adapter, the resulting strain was found in the same morphological and cultural characteristics with the starting strain. Each strain was able to grow in 18mL/L medium seeds, recombinant strains with good genetic stability.

Keywords: Clostridium beijerinckii butanol resistance ABE fermentation

目录

摘要 I

Abstract II

第一章文献综述 1

1.1 丁醇的性质、用途 1

1.1.1 丁醇的性质 1

1.1.2 丁醇的用途 1

1.2 生物丁醇产业的历史与现状 2

1.2.1生物丁醇产业的历史 2

1.2.2生物丁醇产业的现状 2

1.3 生物丁醇发酵存在的问题 2

1.3.1 丁醇发酵代谢机理 2

1.3.2丁醇对细胞的毒性机制 3

1.3.3 丁醇的耐受机制 3

1.4 课题内容 4

1.5 课题意义 4

第二章材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1菌株和质粒 5

2.1.2 培养基 5

2.1.3 培养方法 5

2.1.4 分析方法 6

2.1.5 工具酶和试剂盒 6

2.1.6实验仪器 7

2.1.5实验试剂 8

2.2 实验方法 9

第三章构建拜氏梭菌基因 Cbei_3255缺陷性菌株 10

3.1 构建敲除质粒 10

3.1.1设计内含子 10

3.1.2 PCR扩增内含子序列 10

3.1.3 酶切失活载体pWJ 11

3.1.4 连接 11

3.1.5 转化E. coli DH5α 12

3.1.6 测序验证 12

3.2 甲基化插入失活载体pWJ-3255 12

3.3 电转化甲基化的敲除质粒至Clostridium beijerinckiiNCIMB 8052 12

3.5 筛选Cbei_3304插入失活突变株。 13

第四章缺陷株的丁醇抗逆性和遗传稳定性研究 14

4.1 Cbei_3255基因缺陷株丁醇抗逆性研究 14

4.1.1 最高丁醇耐受浓度研究 14

4.2 Cbei_3255基因缺陷株遗传稳定性 15

第五章结论与展望 16

5.1 结论 16

5.2 展望 16

参考文献 17

致谢 19

第一章文献综述

1.1 丁醇的性质、用途

1.1.1 丁醇的性质

丁醇的分子式为C₄H₉OH，分子量为74.12。丁醇是无色透明，具有特殊气味的液体，与乙醇\乙醚及其他多种有机溶剂混溶，蒸汽与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限1.45-11.25（体积）。丁醇的理化性质，具体见表1-1^[1,2]。

表1-1 丁醇的理化性质

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