论文总字数：14715字

摘 要

冬虫夏草作为一种珍贵的中药材，具有免疫调节作用、抗肿瘤、抗氧化等多种作用，然而天然冬虫夏草的生长条件苛刻，产量极低，远不能满足实际应用的需要。利用人工发酵培养冬虫夏草菌，其药理作用完全可以达到天然冬虫夏草的效果，但由于优良菌株的缺乏、发酵条件及生产成本等限制，冬虫夏草菌人工培养尚未实现大批量高效益的产业化，因此进行人工发酵培养冬虫夏草菌的研究变得十分必要，本课题在获得优良冬虫夏草的基础上展开了以下研究工作：

1.参考现有文献报道，建立了冬虫夏草中主要有效成分的提取及检测方法。以热水回流提取法提取虫草多糖，用苯酚—硫酸法测定多糖含量。虫草酸的提取同样采取水热回流法，测定方法采用比色法。腺苷、尿苷、肌苷、鸟苷、虫草素等核苷类物质的提取采用乙醇热回流法，其测定使用高效液相色谱法。以市场购得的虫草花为原料进行有效成分提取，结果表明其有效含量尤其是腺苷及虫草酸含量极低。

1. 由于虫草菌的生长周期较长，本课题首先优化了菌株的培养时间。研究发现菌株发酵上清液中有更高的多糖含量，而在菌丝体中虫草酸和腺苷的含量更高。多糖及虫草酸的产量在发酵15d时达到最大，胞外多糖含量达到7.82g/L，胞内多糖的含量达1.037g/L，上清液中虫草酸含量为0.698g/L，胞内虫草酸含量2.615g/L。而发酵20d更加有利于核苷类物质的积累，胞内尿苷、鸟苷、虫草素和肌苷的含量分别为0.033、0.05、0.05、0.036g/L，而发酵上清液的含量明显降低。

关键词：冬虫夏草 多糖 虫草酸 核苷类物质 发酵优化

The research of Cordyceps sinensis CS01 fermentation technology

ABSTRACT

Cordyceps sinensis as a precious medicinal herbs has immunomodulatory effect, anti-tumor, antioxidant and other role,The growth of natural cordyceps strict, however, production is extremely low, far cannot satisfy the needs of practical application.By using artificial culture cordyceps fungus fermentation,Its pharmacological effects can achieve the result of natural cordyceps sinensis,But due to the lack of good strains and fermentation conditions and the production cost and so on limit, not artificial Chinese caterpillar fungus bacteria cultivation in this large quantities of high benefit of industrialization,so the artificial cultivation of cordyceps fungus fermentation research become very necessary.This topic on the base of the excellent Chinese caterpillar fungus on the following research work.

1. Referencing literature reports,we established the extraction and test methods of

the main effective components in Cordyceps sinensis such as polysaccharide, cordyceps acid and nucleoside class materials.Cordyceps polysaccharide is extracted by hot refluxing extraction, using the phenol - sulfuric acid method determination of polysaccharide content.Cordycepic acid extraction also take water hot reflux method, the determination method using colorimetric method.Nucleoside class material such as adenosine, uridine, inosine, guanosine, cordycepin use hot ethanol reflux method, its determination using high-performance liquid chromatography (HPLC).With Chinese caterpillar fungus flowers from market as a raw material for extracting effective components, the results show that the effective content especially adenosine and cordyceps acid content is extremely low.

1. Because the growth period of cordyceps sinensis is longer than the other,the cultivation time of the strains was optimized in this topic at first.The study found that strains fermentation that have a higher content of polysaccharide in supernatant fluid, and in the mycelium of cordyceps acid and the content of adenosine is higher.Production of polysaccharide and cordyceps acid in fermentation maximum when the 15 d, extracellular polysaccharide content is 7.82 g/L,The content of intracellular polysaccharides of 1.037 g/L.In the supernatant acid content is 0.698 g/L,Intracellular acid content is 2.615 g/L.And fermentation 20 d more conducive to nucleoside class material, the accumulation of intracellular uridine, and guanosine, cordycepin and inosine content were 0.033, 0.05, 0.05, 0.036 g/L, and fermented supernatant content decreased obviously.

Key Words: Cordyceps sinensis polysaccharide cordycepic acid nucleoside class material optimization of fermentation

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 前言 1

1.1冬虫夏草概述 1

1.2冬虫夏草中活性成分及其药理作用 1

1.2.1虫草多糖 1

1.2.2 虫草酸 2

1.2.3 核苷类物质 3

1.3 发酵技术研究综述 3

第二章 冬虫夏草中有效成分的提取和检测 5

2.1实验材料 5

2.1.1 实验仪器 5

2.1.2实验试剂 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 虫草多糖的提取 6

2.2.2虫草多糖检测 6

2.2.3 虫草酸的提取 7

2.2.4 虫草酸的测定 7

2.2.5 核苷类物质的提取 8

2.2.6 核苷类物质的测定 8

2.3结果与讨论 10

第三章 冬虫夏草菌的培养及优化 11

3.1 冬虫夏草菌摇瓶培养时间优化 11

3.1.1 实验试剂 11

3.1.2 实验仪器 11

3.1.3 培养基配制 12

3.1.4 实验方法 12

3.2结果与讨论 14

文献参考 17

致谢 18

第一章 前言

1.1冬虫夏草概述

冬虫夏草是我国著名的中药材，作为药材，它有着十分珍贵的药用价值，它同样可最为食材进行烹饪制成药膳，和鹿茸、人参等一样都是很好的补品。冬虫夏草属于真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina) 、核菌纲(pyrenomyerees)、麦角菌目 (Clavieipitales) 、 麦角菌科(Clavieipitaceae)、虫草属(eordyeeps)^[1]。冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)sacc]为冬虫夏草菌寄生在蝙蝠科昆虫蝙蝠蛾(HPeailusnarloricnausobehrtur)越冬幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草是一个统称，是指所有的能产生子座的虫草菌菌物复合体，全世界报道的虫草物种有400多种^[2]，其中我国报道的有70多种^[3]。而我们传统中所说的冬虫夏草主产于四川、青海、西藏、云南、贵州等海拔4000~5000m的山中。

1.2冬虫夏草中活性成分及其药理作用

冬虫夏草含有虫草多糖、虫草酸、蛋白质和氨基酸、糖醇、甾醇类、超氧化物歧化酶（SOD）、多种微量元素以及可用于制作新型免疫制剂的抗生素，其中多糖、虫草酸和核苷类物质是其主要的有效成分。

1.2.1虫草多糖

虫草多糖是冬虫夏草中含量最多的活性成分。它主要由多分支的杂多糖组成，成分不单一，Miyazaki^[4]等从冬虫夏草子囊果中得到水溶性多糖Cs-I和Cs- II，它们的单分子组成为 D-半乳糖:D-甘露糖= 1:1。其中Cs-I是用热水提取的一种水溶性胞外多糖，是具有高度分支的多聚糖。龚敏^[5]等用 SephadexG-75 柱分析虫草多糖CS-81002，盖新杰^[6]等对1株蛹虫草多糖的结构进行鉴定均证明虫草多糖是由多种单糖聚合的杂多糖。

近年来的临床研究表明虫草多糖具有抗肿瘤、提高人体免疫力、降血糖、抗氧化等药理学作用。朱培新对从冬虫夏草中分离出来的一种多糖CSPS进行了药理学研究。体外免疫学活体实验结果表明，CSPS在实验浓度范围内可以增强巨噬细胞的吞噬活力，显著促进淋巴细胞增殖、增加脾淋巴细胞所产生的TNF-a的含量。CSPS具有增强免疫的作用。体外抗癌实验结果表明，CSPS能抑制小鼠S180肿瘤细胞的增殖,且在实验浓度范围内,呈现出明显的剂量依赖效应。表明提取出的CSPS具有抗癌活性。CSPS还原力测试结果表明,其具有一定的还原能力,且随着多糖浓度的提高,还原力呈上升趋势^[7]。

虫草多糖的提取方法比较多，有水热回流提取法、超声波辅助水提法、微博辅助水提法、超高压辅助水提法等。虫草多糖的提取工艺采用较多的是热水浸提法，这种提取方法适合大规模应用，且通过对提取剂和提取工艺的优化可以显著提高产量。由于虫草是食用的，为了保障安全较多采用蒸馏水和乙醇或者两者不同比例的混合物作为提取剂。提取后的是粗糖，还要进行进一步的纯化，常用的纯化方法有活性炭脱色，纯水透析，乙醇分级沉淀，DG-52柱层析等^[18]。

1.2.2 虫草酸

Chatterjee^[8]等首次从冬虫夏草中分离出甘露醇时，误认为它的结构是1,3, 4, 5-四羟基环己烷酸，于是命名为“虫草酸”。但Sprecher^[9]等对“虫草酸”进行再次鉴定后确定其结构是甘露醇，并且通过物理和化学的方法确定其为D-甘露醇。甘露醇具有利尿、脱水、镇咳、祛痰、平喘、提高血浆渗透压、清除人体内强毒性的羟自由基等作用，并且对多种疾病有一定的疗效。

虫草酸的提取方法和多糖比较类似，对于虫草酸的研究较多集中在它的测定上，测定方法有容量法，比色法，波层扫描法等，比色法可排除其他还原性物质的干扰，它的结果更为可靠，故测定时使用比色法比较好^[19]。王祖华等采用比色法分别对天然虫草与人工培养虫草中甘露醇进行了测定，发现人工发酵虫草甘露醇的含量为4.23%，平均加样回收率为100.76%，变异系数（RSD）为1.92%，天然虫草甘露醇的含量为11.0%，平均加样回收率为100.52%，RSD为1.38^[20]。通过比较得出人工发酵和天然虫草的干露醇含量有很大差异，这也为我们发酵条件的优化提供了很大空间。

1.2.3 核苷类物质

冬虫夏草中含有多种核苷类物质，有3′-脱氧腺苷、腺苷、鸟苷、肌苷等，其中3′-脱氧腺苷即为虫草素的化学本质，虫草素是冬虫夏草中极具特色的活性物质，也正因此成为国内外研究的热点。

大量的临床试验发现了虫草素的多种药理学作用，刘东泽等报道虫草素具有自身免疫调节的作用，可增强体液免疫调节作用，抑制细胞分裂，促进 T 淋巴细胞转化等^[10]。柴建平等研究表明，虫草素磷酸可抑制 RNA 和 DNA 的合成，这可能与虫草素的抗肿瘤作用有关^[11]。虫草素还对多种致病细菌和致病性真菌具有抑制作用，在治疗细菌真菌感染类疾病方面具有重要作用^[12]。另有报道，虫草素还具有一定的抗病毒活性，对人类免疫缺陷病毒的侵染和反转录酶活性也有抑制作用^[13]。

腺苷是指腺嘌呤核苷酸，具有广泛的心脏效应。大量研究表明，腺苷具有触发或介导缺血预适应、减轻再灌注损伤等心脏保护效应，同时它可用于心律失常的诊断和治疗。肌苷为次黄嘌呤核苷酸，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，并可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等疾病。鸟苷指鸟嘌呤核苷酸，其不具有明显的药理活性。

核苷类物质的提取方法较多，有超声波法、化学渗透法及冻融法.结果表明,用化学渗透法较其他方法破碎率较高，其中又以20%三氯乙酸破碎效果最佳。

1.3 发酵技术研究综述

毛先兵^[21]等以北冬虫夏草为材料来研究不同碳源及碳氮比对于生物反应中有效代谢产物虫草素（3’-脱氧腺苷）产量的影响。在实验中进行对比研究的碳源有乳糖，蔗糖，葡萄糖，果糖，半乳糖，麦芽糖，木糖，最终确定葡萄糖为生成虫草素的最佳碳源，而半乳糖最益于细胞的生长。最佳碳源和氮源条件下，虫草素可达到的最大产量和产率是354.4±8.5mg/l和19.2±0.5mg/l每天，这个研究结果的获得对于大规模深层培养北冬虫夏草生产虫草素将十分有帮助。发酵中，温度和PH对于菌的生长以及产物产量有着十分大的影响，鲍晓华^[22]等研究了影响虫草菌发酵的一些因素，虫草的产地一般在高寒地区，故最适温度较低，研究认为虫草菌生长适温为26℃，当发酵温度小于26℃ , 虫草菌生长缓慢, 菌丝体生长得很少, 如果温度过低, 虫草菌会出现负增长,特别是产物合成阶段。在生产中, 发酵PH应维持在5.6~6.8，虫草菌发酵生产的 PH 值低于5. 6 时用加减的办法来提高 PH 值, PH 值高于6. 8 时, 加补料基的方法来降低 PH 值。溶解氧与呼吸强度关系和溶解氧与比生长速率关系对溶解氧浓度做出选择, 一般情况下, 虫草菌发酵生产需氧浓度是 0. 03- 0.05mg/ L. 在具体操作时可提高增加通气量, 提高搅拌功率来达到, 虫草菌发酵后期, 其粘度略为提高. 此时提高搅拌功率即可。接种量对发酵也有着一定影响，一般虫草菌菌种选择在对数生长期的后期比较适宜, 此时的虫草菌菌种活力高, 密度适当, 是接种发酵的最好时期, 此时的接种量选择5% - 6%。

第二章 冬虫夏草中有效成分的提取和检测

2.1实验材料

2.1.1 实验仪器

表2-1 实验仪器

2.1.2实验试剂

表2-2 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 虫草多糖的提取

准确称取充分干燥后的虫草子实体5g，虫草子实体由市场购得，加入50ml蒸馏水，将恒温水浴锅加热到90℃，回流抽提1.5h，过滤收集滤液，再加入100ml蒸馏水重复抽提2次，合并滤液。总共得到250ml滤液。

2.2.2虫草多糖检测

1.葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取烘干至恒重的葡萄糖10mg，置于100ml容量瓶中，加入蒸馏水，滴定至刻度线，配成0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。吸取葡萄糖标准液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9ml分别置于10ml具塞试管中，补水至2ml，各管加入新配5%苯酚溶液2ml，摇匀，迅速加入浓硫酸7.5ml，摇匀后静置5min，在沸水浴中加热15min，取出冷却到室温，用分光光度计测490nm时的吸光度值，空白试剂为参照。以各管吸光度值为横坐标，对应的葡萄糖浓度为纵坐标作出标准曲线，纵坐标单位为mg/ml。

图2-1 葡萄糖标准曲线

得到的回归方程为y=0.1072x 0.0067，其中R²=0.9867

2 .样品测定

将提取得的多糖溶液稀释100倍，取稀释的待测样品2ml，加入5%苯酚和浓硫酸，试剂量与操作方法与制作标准曲线时相同，测得490nm处吸光度值为

0.822，其中空白试剂为参照。经过计算得糖含量为9.482mg/ml。

2.2.3 虫草酸的提取

精确称取虫草子实体2.5g，置于圆底烧瓶中，加入100ml蒸馏水，80℃水浴中回流抽提1h，重复操作1次，合并滤液即可得到粗的虫草酸200ml。

2.2.4 虫草酸的测定

1.虫草酸标准曲线的绘制

精确称取D-甘露醇0.04g加入100ml容量瓶中，配制成400μg/ml标准虫草酸溶液，取标准溶液0.1，0.5，1.5，2.0，2.5ml于试管中，分别补水到10ml，配制成不同浓度溶液。再各取1ml溶液于试管中，分别加入0.015mol/L高碘酸钠溶液1ml，室温放置10min，加入0.1%L-鼠李糖溶液2ml，再加入Nash试剂4ml，将加入试剂的试管置恒温水浴锅中53℃加热显色15min。以空白试剂作为对照，测其在波长413nm处的吸光度值。以各管吸光度值为横坐标，对应的虫草酸浓度为纵坐标作出标准曲线，其中纵坐标单位为μg/ml。

图 2-2 D-甘露醇标准曲线

其中回归方程为y=96.718x-0.1196，其中R²=0.9998。

2.样品测定

取提取的虫草酸溶液1ml，加入0.015mol/L高碘酸钠溶液1ml，室温放置10min，加入0.1%L-鼠李糖溶液2ml，再加入Nash试剂4ml，将加入试剂的试管置恒温水浴锅中53℃加热显色15min。以空白试剂作为对照，测其在波长413nm处的吸光度值，测得吸光度值为0.213，计算可得样品中虫草酸的浓度为20.418μg/ml。

2.2.5 核苷类物质的提取

精确称取5g充分干燥的虫草子实体，置于圆底烧瓶中，加入50ml 57%乙醇，在90℃水浴中回流提取1h，再加入100ml 75%乙醇回流提取1h，重复操作1次，合并滤液得250ml提取液。经过悬蒸浓缩后得到107ml滤液。

2.2.6 核苷类物质的测定

1.标准曲线的绘制

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