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麦芽三糖酶对蜡质玉米淀粉的水解机理及水解物的降解特性

摘要：本研究探讨了麦芽三糖酶(AMTS)的水解机制。采用不同外链长度的支链淀粉(ECL)对AMTS进行动力学参数分析。用AMTS对蜡质玉米淀粉进行不同程度的凝胶化和水解;测定淀粉水解产物的降解率。beta;-糊精-3的米氏常数(Km)比支链淀粉(ECL 17.8)高8倍，但其催化效率(kcat/Km)仅为支链淀粉的6.5%。AMTS优先于外链而不是内链水解支链淀粉，AMTS通过外作用和内作用相结合的方式水解支链淀粉。在水解初始阶段，AMTS的外解作用占主导地位，分子量下降缓慢，淀粉样链的内链变化不大。当水解度为2.1%时，麦芽糖在可溶性寡糖（PM）中的含量为90.5%，当水解度为35.4%时，麦芽糖在可溶性寡糖中的含量由90.5%逐渐下降到71.2%。PM降低的部分原因可能与AMTS转糖基化反应的增加有关。通过增加短外链和低分子量糊精的gt;15.9%的水解，观察到完全抑制支链淀粉的退化。这些结果表明，AMTS可以有效地延缓淀粉在烘焙制品中的退化。

关键词:麦芽三糖酶 水解机制 支链淀粉 退化

1.介绍

麦芽三糖酶(AMTS;EC 3.2.1.1 16)是糖苷水解酶家族的成员13 。AMTS依次从淀粉的非还原性末端去除麦芽糖单位。AMTS从淀粉中生产高质量的麦芽糖成本低，前景广阔。此外，AMTS是一种特殊的糖基转移酶，将麦芽三糖基单位转移到酚和醇类化合物。因此，AMTS可用于麦芽糖的生产和麦芽糖糖苷的合成。

淀粉酶通过不同的作用机制水解淀粉的alpha;-1,4键。beta;-淀粉酶是一种外作用酶，从非还原端切割淀粉链，使产物的异位构型发生逆转;而alpha;-淀粉酶是一种内作用酶，它可以在不改变异位构型的情况下随机水解淀粉链。AMTS也是麦芽糖形成淀粉酶的一种，由于产生特定糖的可能性高，通常被归类为外作用淀粉酶。然而，值得注意的是，北孢子菌AMTS的酶促作用。随着水解程度的增加，MK-1785可能从内链模式转变为外链模式，向直链转变。此外，正常玉米淀粉被AMTS通过联合外泌和内吞作用水解。这些结果表明，AMTS可能具有与麦芽源性alpha;-淀粉酶相似的作用模式，表现为内作用和外作用模式。

麦芽源alpha;-淀粉酶是一种广泛应用于烘焙食品中的抗变质酶。关于淀粉的凝固性，支链淀粉的重结晶是淀粉在长期贮藏中硬度增加和凝固性增加的原因。重结晶通过增加面包屑的硬度和降低面包屑的弹性来限制烘焙产品的保质期。麦芽源alpha;-淀粉酶缩短支链淀粉的外链，从而防止再结晶并阻碍水的流动性。然而，关于AMTS对支链淀粉的降解机制以及在延缓支链淀粉退化方面的作用的研究还很少。

本研究以支链淀粉为原料，利用AMTS对蜡质玉米淀粉进行不同程度的水解。测定了淀粉的结构、链长分布和淀粉水解产物的降解。此外，通过对不同外链长度支链淀粉上AMTS的动力学参数进行分析，进一步探索该酶的水解机理。本研究的目的是:1)评价AMTS对支链淀粉的水解作用及其作用机制，2)将水解产物的结构与其降解性质联系起来。我们的研究结果将对AMTS在烘焙产品中的潜在应用具有重要意义。

2 材料和方法

2．1 材料

蜡质玉米淀粉从杭州普罗星淀粉有限公司获得。大麦(A7130)的beta;-淀粉酶购自西格玛-奥德里奇化学公司。假单胞菌(Pseudomonas sp.)的异淀粉酶(E-ISAMY)和植物克雷伯菌(Klebsiella planticola)的普鲁兰酶M1 (E-PULKP)均来自爱尔兰国际股份有限公司（爱尔兰威克洛县。来自帝王微菌的AMTS(AMT 1.2L)购自天野酶公司(日本名古屋)。

2.2 淀粉分散体的制备

蜡质玉米淀粉的水淀粉分散体制备我们以前报道的程序。淀粉分散在二甲亚砜(DMSO)溶液(90%，w/v)中，在100℃持续搅拌1小时，在30℃持续搅拌12小时。加入7体积乙醇后，淀粉分散体在3000转下离心10分钟。将得到的球团分散在不同的体系中，即热缓冲液、热流动相或热水中，并在100℃下搅拌20分钟。

2．3 不同外链长度支链淀粉(ECL)的制备

以大麦beta;-淀粉酶水解蜡质玉米淀粉为原料，按照Hamaker B.R. 等的方法进行轻微修改，制备不同ECL (beta;-糊精)的支链淀粉。用乙酸钠溶液(0.05 M, pH 4.5)按照2.2节的步骤制备蜡状玉米淀粉分散体(1% w/v)，然后在50℃平衡。在不同的时间加入大麦beta;-淀粉酶(3 U/g淀粉)孵育。经过指定的孵育时间后，将该混合物与7体积乙醇混合，在4℃保存12 h，然后在 25℃下离心(3000 g)10分钟。沉淀物用乙醇溶液(80% v/v)洗涤两次，用丙酮洗涤一次，在35℃下强制干燥，保存在干燥器中以供进一步分析。beta;-糊精的平均链长(CL)和平均外链长(ECL)按照Yun和 Matheson和Shen, Bertoft, Zhang和Hamake的方法测定。

2．4 AMTS纯化、酶学分析和动力学参数分析

根据我们之前描述的实验室程序，使用KTA净化器trade;10系统，配备HiTraptrade;脱盐和HiTraptrade;Q FF柱(GE 医疗保健，乌普萨拉，瑞典)，将AMTS纯化 。采用Somogyi-Nelson法，在50℃下，通过定量1%可溶性淀粉溶液(pH 6.5, 0.1 M磷酸盐缓冲液)产生的还原糖的数量来评估AMTS的酶活性。1个酶单位被定义为每分钟产生1.0 mmol麦芽糖所需的AMTS量。

对于动力学参数分析，AMTS反应在标准酶活性测定条件下，用支链淀粉和一定浓度范围的beta;-糊精进行(0.6e20 mg/mL)。采用GraFit 7 (意大利软件有限公司，斯坦斯，英国)，按照Hye-yeon Jeon等人的方法拟合米氏方程，计算出米凯利斯常数(Km)、催化常数(kcat)和催化效率(kcat/Km)。

2．5 糯玉米淀粉的酶解研究

按照Grewal等人的方法进行蜡质玉米淀粉的酶解。将蜡质玉米淀粉(30 g)悬浮在1 L 0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 6.5, 5 mM Ca2thorn;)中，在沸水浴中持续搅拌(400 rpm) 40分钟。悬浮液在121℃高压灭菌30分钟，然后冷却到50℃。用AMTS (10 U/g淀粉)在50℃下水解淀粉悬浮液，在不同的时间间隔去除水解产物，得到不同程度的水解。在沸水浴中加热10分钟，冷却至室温。样品的一部分被分析糖类组成，另一部分被冷冻干燥做进一步分析。

2.6 糖类成分分析

利用脉冲安培检测器系统(HPAEC-PAD) (戴安 ICS-5000, 戴安公司， 森尼维尔, , 美国)，通过高效阴离子交换色谱分析蜡质玉米水解产物上清液的糖类结构。样品过滤后注入HPAEC-PAD系统，该系统与Dionex CarboPactrade;PA200 (3 times;250毫米)柱结合。洗脱液为(A) 150 mM NaOH和(B) 150 mM NaOH加500 mM乙酸钠。洗脱B的梯度程序为:0 min 40%， 2 min 50%， 10 min 60%， 40 min 80%， 0.5 mL/min。以低聚麦芽糖(聚合度DP:1e7)为标准。以还原糖含量为基础，将糖成分分析注射样品在去离子水中稀释至50 mg/mL。水解度DH的计算如下式:

DH（%）=不同DP条件下测定的总糖含量/总淀粉含量（干重)times;100 (1)

麦芽糖在可溶性低聚糖(PM)中的比例计算如下:

PM(%)=麦芽三糖含量/不同DP条件下测定的总糖含量times;100 (2)

2.7 尺寸排除色谱(SEC)

将淀粉分散在0.3 M硝酸钠溶液(含0.02%叠氮化钠)热流动相中，通过5 mm膜过滤器，注入高效尺寸排除色谱(HPSEC)体系。HPSEC系统配备了多角度光散射检测器(MALLS, Dawn Heleos-II；怀亚特技术, 圣巴巴拉, 美国)和RI探测器(Optilab T-rEX;怀亚特科技，圣巴巴拉，加州，美国)。尺寸排除色谱柱Shodex OH pak SB-806和SB-804(昭和Denko K.K.川崎，日本)串联使用，流速为0.6 mL/min, 50℃。采用Astra 5.3.4软件(怀亚特技术公司, 圣巴巴拉, 美国)进行数据分析。利用二阶Berry方法计算了旋转的Mw和平均旋转半径(Rz)。本计算选取RI为1.333,dn/dc为0.147。

2.8 脱支和链长分布分析

将分散在热水中的淀粉冷却至室温，与1体积的醋酸缓冲液(pH 4.0)和异淀粉酶(10 U/g淀粉)混合。混合物在37℃下连续搅拌24小时。为了使异淀粉酶失活，样品加热到100℃10分钟，然后冷却到50℃。调整反应混合物pH为5.5，加入普鲁兰酶(5 U/g)。在50°C孵育24小时后，普鲁兰酶被灭活，并加入9体积的乙醇。制备了去支化淀粉(0.5%，w/v)的水分散体，并用HPAEC-PAD测定了淀粉链的长度分布。

2.9 差示扫描量热(DSC)分析

冷冻干燥的淀粉水解物和水(40%固体，w/w)在DSC锅中称重，随后将其密封，从4℃加热到95℃，温度为1 0℃/min，并且在DSC7000进行分析(精工仪器公司，千叶，日本)。一只空锅被用作参考。第一个盘在第0天进行分析，第二个盘在4℃储存后第7天进行分析。使用Muse作业软件(精工仪器，千叶，日本)计算起始(To)、峰值(Tp)和结论(Tc)温度和焓。

2.10 统计分析

每个分析都重复进行三次。数据分析使用PASW Statistics 18 (SPSS Inc.， 芝加哥, IL, 美国)进行。3次重复分析的结果以均数plusmn;标准差(SD)表示。比较的最小显著性差异(LSD)设置为p lt; 0.05。

3 结果与讨论

3.1 beta;-糊精的制备及动力学参数分析

大麦beta;-淀粉酶能从支链淀粉外链中单独去除麦芽糖，因此，用淀粉酶水解不同时间的蜡质玉米淀粉，制备出具有不同ECL的支链淀粉。表1显示底物的CL和ECL的下降顺序为支链淀粉gt;beta;-糊精-1gt; beta;-糊精-2gt;beta;-糊精-3。这些结果与Hamaker B.R. 等(2013)报道的beta;-糊精的结果一致。beta;-糊精-3的ECL和CL分别为2.3和1 1.9，与文献对糯玉米淀粉beta;极限糊精的描述相似。因此，可以选择beta;-糊精-3作为底物，直接研究AMTS对支链淀粉内链的亲和性。

使用支链淀粉和b-糊精在一定浓度范围内对AMTS进行动力学分析。在表1中，AMTS的Km随着ECL的降低逐渐增大，kcat/Km同时减小。这些结果表明，该AMTS对支链淀粉具有较高的亲和力，具有较高的ECL。beta;-糊精-3的Km是支链淀粉的8倍，但kcat/Km仅为支链淀粉的6.5%。在之前的文献报道中，植物乳杆菌中发现了一种新的形成麦芽糖的a-淀粉酶，其对麦芽糖的Km和kcat/Km均高于麦芽糖基beta;-CD，表明该a-淀粉酶更倾向于a-1,6链而不是a-1,4链进行水解。因此，AMTS对支链淀粉内链的亲和性远低于支链淀粉外链。

表1显示，底物的kcat和kcat/Km按支链淀粉gt;beta;-糊精-1gt;beta;-糊精-2gt;beta;-糊精-3的顺序下降。在支链淀粉的分支结构中，较长的外链表示离分支点较远的淀粉的线段，较短的外链或内链表示分支点附近或分支点之间的淀粉的线段。因此，可以推断AMTS在离分支点较远的淀粉线段上的反应速率比在分支点附近或分支点之间的淀粉线段上的反应速率大。

表1 AMTS对不同外链长度b-糊精的动力学参数分析

3.2 AMTS水解玉米蜡质淀粉和可溶性糖类的释放

为探讨AMTS对蜡质玉米淀粉的作用机理，采用AMTS对蜡质玉米淀粉进行水解，得到不同的DH值。水解后单个糖类(基于初始干淀粉重量)释放的百分比见表2。形成低聚麦芽糖(DP 1-11)，其中以麦芽糖为主要糖类。形成麦芽糖的淀粉酶通常被定义为外作用淀粉酶，因为它具有产生特定糖的高概率。2.1% DH时PM为90.5%，35.4% DH时PM由90.5%逐渐降至71.2%。随后，含有DP 5e11的糖类被水解，从而增加PM。当DH高于26.9%时，可获得DP 8e11型糖类。随着水解过程的进行，麦芽六糖出现并积累，说明淀粉水解过程中可能转移到麦芽三糖。研究表明，低聚麦芽糖水解过程中发生了麦芽糖三糖转移。转糖基化反应随着DH的增加而增加，这可能是在水解过程中DP 411的糖产量增加和PM降低的最可能的解释。本研究未对AMTS从支链淀粉内链产生的糖类组成进行研究。因此，AMTS水解的内链对降低的PM可能的贡献不可能排除在外。

表2 AMTS不同水解时间下糯玉米淀粉水解产物的糖类组成，以HPAEC为指标

3.3 AMTS水解淀粉的Mw和z-平均旋转半径(Rz)

为了进一步揭示AMTS对支链淀粉的作用，我们利用HPSEC-MALLS-RI分析了蜡质玉米淀粉水解后分子结构的变化。蜡质玉米淀粉hpsec - mals - ri层析及相应amts水解样品的信号如图1所示。RI图显示了AMTS水解后洗脱体积的变化和延迟(图1a)。随着水解时间的增加，随着摩尔质量分布的逐渐降低，LS信号(瑞利比)逐渐减小并延迟(图1b)。

随

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