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通过优化补料方式和发酵条件，提高重组枯草芽孢杆菌的普鲁兰酶产量

摘要：普鲁兰酶是一种重要的淀粉脱支酶，主要用于与淀粉加工相关的食品工业。重组枯草芽孢杆菌虽然是一种普遍公认的安全(GRAS)宿主，但是其产生的普鲁兰酶水平通常是有限的。为了提高普鲁兰酶的活性，系统研究了普鲁兰酶的分批发酵和补料分批发酵。最终目的是通过优化发酵过程中的补料策略来提高发酵产量，从而提高普鲁兰酶的活性。因此，本研究对补料方式、补料成分、补料浓度和pH值进行了详细的研究。研究得到的优化过的重组枯草芽孢杆菌生产普鲁兰酶的发酵条件为：接种量为7%，pH值为6.5，溶解氧水平为30%，100 mL葡萄糖溶液(400g/L)，这样的发酵条件下菌种在后期呈对数增长的趋势。在600 nm处重组枯草芽孢杆菌的吸光度、酶活性分别为84.54和102.75U/mL，分别比优化前分别高出141%和144%。这些发现为进一步放大发酵系统以获得更高的酶活性提供了先决条件。

关键词：普鲁兰酶；枯草芽孢杆菌；发酵过程；优化；补料策略

介绍

普鲁兰酶(EC3.2.1.41)是一类催化水解未修饰底物的alpha;-1, 6糖苷键的淀粉脱支酶。普鲁兰酶分解分支的能力突出了其作为有前途的淀粉酶新品种之一的特殊性，使其广泛应用于各个领域。在淀粉工业中，普鲁兰酶和淀粉酶协同使用可以提高淀粉糖化的效率，降低生产成本。目前，淀粉工业主要以淀粉为基础原料，原料中的淀粉含有近四分之三的支链淀粉。此外，普鲁兰酶在制药和饲料工业中也发挥着突出的作用。

枯草芽孢杆菌作为一种 GRAS 菌株，具有许多优点，并被广泛用作生产食品加工相关酶的表达宿主。缺乏外膜和密码子使用的显着偏差使普鲁兰酶能够更有效地分泌（2005）并且目标蛋白能够有效地转录和翻译。尽管先前报道了多种能够表达普鲁兰酶芽孢杆菌系统，但使用枯草芽孢杆菌系统生产的普鲁兰酶的在产量和活性方面仍存在一些局限性。涉及重组结构的方法被用于提高普鲁兰酶的异源表达。邓等人（2018）通过优化重组菌株的增强剂，开发出用于生产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌WB800/pMA0911-P_sacB-pul-degQ（N），在摇瓶中培养菌株产生的普鲁兰酶活性达到26.5 U/mL。此外，通过优化发酵培养基和一般条件，可以在更温和的条件下提高酶的产量。刘等人（2012）优化发酵培养基和发酵条件，使枯草芽孢杆菌 WB600/pWB-pulB普鲁兰酶的酶活性达到了20.16 U/mL。由于不同的微生物对代谢物的生长和产生都有其有利的过程和条件，因此探索合适的发酵模式和优化发酵工艺具有重要意义。

生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌株本身的性能，还取决于提供的发酵条件是否适合，能够充分利用菌株的生产能力（2019）。优化发酵工艺可以充分发挥该菌株的潜力，提高发酵工艺的生产效率，间接降低生产成本（2018）。因此，工艺优化的研究尤为重要。在发酵生产中，可以直接或者间接人为地调节反应条件。发酵过程中的温度、pH值、溶解氧等因素都会影响微生物的生长和代谢。王等人。王等人（2014）优化了重组菌株枯草芽孢杆菌WB800碱性淀粉酶的发酵条件，优化后的产量比优化前提高了3.36倍。黄等人（2004）通过优化补料策略大大提高了枯草芽孢杆菌淀粉酶的产量。

现阶段有许多补料策略，主要分为反馈补料和非反馈补料两种。根据补料的速度，可分为恒速补料和变速补料。通过不同的研究优化发酵方法，可以大大提高发酵过程的生产效率，从而降低生产成本（2013）。最佳的发酵条件和合适的补料策略对细胞生长和蛋白质表达至关重要（2017）。

本次我们研究了分批发酵和补料分批发酵之间的差异，并进一步探讨了恒溶氧补料法和恒速补料策略两种补料方法的特点。通过在恒速补料下添加不同浓度的葡萄糖和蔗糖确定最佳补料碳源和最佳浓度。随后，我们研究了发酵系统pH值对工艺的影响。最后，结合优化后的发酵条件测定重组普鲁兰酶的酶活性。

材料和方法

菌株、培养基和发酵条件

本研究中使用的枯草芽孢杆菌 WB800-P_HpaⅡ-pul 是在我们实验室构建的（2019）。经过重组的枯草芽孢杆菌WB800常被用作普鲁兰酶生产的宿主。用于测定普鲁兰酶活性的普鲁兰多糖购自东京化成工业株式会社（东京，日本）。DNA聚合酶是从TaKaRa生物技术有限公司（大连，中国）购买获得的。DNA引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司（中国上海）。除非另有说明，否则所有其他试剂均为分析级且可商购。

培养基和补料方法

LB培养基或琼脂平板由10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl 组成，并添加了2%的琼脂粉。种子培养物在含有蔗糖 40 g/L、大豆蛋白胨 30 g/L、磷酸二氢钾 6 g/L、MgCl₂·6H₂O 2.04 g/L的培养基中培养。发酵培养基的组成为蔗糖 70 g/L、大豆蛋白胨 50 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L、MgC_l2·6H₂O 3.06 g/L。补料发酵的补料溶液含有不同浓度的葡萄糖溶液（300 g/L、400 g/L和 500 g/L）和蔗糖溶液（400 g/L）。

种子培养

将储存在-20 °C下的冷冻甘油菌株划线到 LB固体板中，在37 °C下培养10-12 小时进行活化。将培养得到的单个菌落挑入试管中，试管中装有5 mL的种子培养基，在恒温摇床上37 ℃、220 r/min条件下继续培养10-12 h将活化的种子溶液转移，在500 mL的摇瓶中装入50 mL的种子培养基，置于旋转摇床中 。接种量为7% (v/v)，在恒温摇床上37 ℃、220 r/min培养 8-10 h。

生物反应器发酵

选取的生物反应器是一个3L的发酵罐，在这个发酵罐中进行培养。发酵液体积为1 L，通风量为1.5 vvm，初始搅拌速度为300 rpm。将7%的种子培养基添加到改良的半合成培养基中，用于分批或补料分批培养。补料分批发酵需要补充碳源。根据不同的方法，我们选择了恒溶氧补料法和恒速补料法，补料的量为100 mL蔗糖溶液（400 g/L）。定期监测发酵液中的生物量和酶活性。考虑到碳源种类对发酵的影响，我们选择葡萄糖溶液（400 g/L）作为补料溶液与蔗糖溶液（400 g/L）进行比较。然后，为了确定最佳的碳源浓度，我们分别设置了 300 g/L、400 g/L 和 500 g/L三个浓度梯度进行实验。根据相关报道，碳源的添加会影响发酵液的酸碱度（2018），因此最终优化了发酵液的初始pH值。

枯草芽孢杆菌的生物量及酶活性测定

通过测量在600 nm (OD₆₀₀) 处的吸光度来监测生物质。适当稀释含有细胞的发酵液后，使用721紫外-可见分光光度计测量600 nm处的吸光度值（2014年）。

普鲁兰酶的酶活性通过测定普鲁兰酶糖化释放的醛基来测定的（2012）。我们在发酵过程中对发酵液定期取样并在12000 rpm下离心10分钟，然后收集上清液并用缓冲溶液（0.1 M，pH 4.5的醋酸钠缓冲液）以合适的倍数稀释。将200 mu;L 2%普鲁兰酶底物和200 mu;L稀释后的发酵液混合，在60 ℃下水浴20 min作为实验组。对照组反应后加入底物200 mu;L。两组均加入600 mu;L 3, 5-二硝基水杨酸(DNS)，置于沸水浴中5 min，待冷却后，加入3 mL超纯水。将200 mu;L样品转移到96孔板中，并在酶标仪中测量540 nm波长处的吸光度。每组均设置3个平行实验，最后取平均值作为最终的结果。一个单位的普鲁兰酶活性定义为在反应条件下每分钟催化普鲁兰酶底物分解产生还原糖（相当于1 mu;mol葡萄糖）所需的酶量。

结果

分批发酵培养重组菌株

图1 重组枯草芽孢杆菌WB800-P_HpaⅡ-pul的分批发酵。测定发酵过程中600 nm下的吸光度值（橙色曲线）、胞外酶活性（蓝色曲线）、溶解氧（绿色曲线）、pH（浅蓝色曲线）。所有600 nm下的吸光度值和酶活性值都是三个平行实验的平均值和相应的标准差。

枯草芽孢杆菌WB800-P_HpaⅡ-pul在3 L发酵罐中培养50 h。在分批发酵过程中，温度和溶解氧水平分别保持在37°C和30%，pH值为自然值。定期测量生物量和酶活性。如图 1 所示，重组菌株在前2 h 生长缓慢，之后的14 h开始生长迅速。细胞进入稳定期后生物量没有增加；在600 nm下测得的吸光度的最大值为35.12。发酵32 h后，酶活性达到最大值，为42.15 U/mL。在发酵初期，普鲁兰酶的酶活性随着重组菌株浓度的增加而显著增加。 32小时后，酶活性略有下降，但总体保持不变。

总的来说，异源蛋白的表达滞后于枯草芽孢杆菌的生长，并且与其密切相关。在发酵过程中，随着碳源的消耗，pH值不断上升，在发酵50小时的时候达到7.5左右。发酵后期营养物质的消耗和代谢废物的积累可能是限制重组菌株生长和异源蛋白表达的主要原因（2008）。为了提供充足的碳源，我们打算在接下来的实验中优化发酵过程的补料方式和分批补料策略。

补料分批发酵过程中补料方式的影响

为了在发酵过程中获得高密度的重组细胞浓度，避免底物抑制和代谢产物的积累，提出了补料分批发酵策略。通过向生物反应器中添加新鲜的补料，可以克服由于营养不足而招致的过早终止发酵（1992）。补料分批培养是指在分批培养期间向发酵罐中间歇或连续添加一种或多种特定限制性底物，直至发酵过程结束，然后排出培养物的方法（2007）。

为了研究补料方式对普鲁兰酶产生的影响，我们采用了两种常见的策略：恒速补料（非反馈喂养策略）和恒溶氧补料（反馈喂养策略）（表1）。恒速补料的方式操作简单，以恒定速率连续喂料（2007）。源源不断地为细胞提供能量，可以满足外源蛋白生长和表达的需要。第二种补料策略能更直观地反映发酵状态（2015）。采用溶解氧在线监测装置监测溶氧的变化，一旦溶解氧反弹，就加料，保持DO的稳定。两种方法各有其优势；因此，我们进行了进一步的实验，以确定哪种发酵工艺更适合本研究。

发酵液中的碳被大量消耗后，缺乏生长需要的营养物质，因而细胞的耗氧量下降，溶解氧浓度迅速上升（2012），但是添加碳后溶解氧浓度下降。通过这种方式，可以使溶解氧浓度保持在一个恒定的水平。在恒溶解氧补料分批发酵过程中，在发酵初期溶解氧逐渐减少。如图2a所示，当溶氧低于30%时，因为转速的缘故，很快溶氧又恢复到30%。当溶解氧突然升高时，就加入碳源。发酵15 小时的时候，600 nm处的吸光度值最大，为37.68，发酵30 h时，酶活性达到一个最大值，为46.49 U/mL。

表1 两种补料方法的比较

在恒速补料时，枯草芽孢杆菌的生物量在对数生长期急剧增加，碳源被迅速消耗。加料时间过早或者太晚都不利于目标产品的积累。过早补料会刺激细胞生长，加速碳源的消耗；相反，延迟补料会导致养分不足，延缓重组菌株的生长。通过在合适的时间补充碳源，600 nm处的吸光度值和酶活性都得到了一定的提升。如图2b所示，与分批发酵过程类似，转移到发酵罐的重组菌需要适应一段时间后菌株的生长才会迅速。一段时间后，重组菌株的细胞浓度急剧增加，发酵20 h时600 nm处的吸光度值为56.4，此时吸光度最大，发酵35 h酶活性达到最大值，为61.86 U/mL。与分批发酵相比，补料分批发酵的重组菌株浓度和酶活性均有所提高。在酶活性方面，两次补料发酵分别提高了10.3%和46.8%。这一结果表明，碳源缺乏是限制发酵过程的主要因素。

图2 重组菌株枯草芽孢杆菌WB800-P_HpaⅡ-pul的恒溶氧补料发酵(a)和恒速补料发酵(b)。分料发酵测定发酵过程中600 nm处的吸光度值（橙色曲线）、酶活性（蓝色曲线）、溶解氧（绿色曲线）和pH（浅蓝色曲线）。所有600 nm处的吸光度值和酶活性值的三个平行实验的平均值和相应的标准差。

补充碳源后的影响

为了研究补料的成分对发酵的影响，我们选择蔗糖（发酵培养基中使用的初始碳源）和葡萄糖（最常用的碳源）作为枯草芽孢杆菌WB800-P_HpaⅡ-pul补料分批发酵的碳源。如图3a所示，补充葡萄糖和蔗糖时，600 nm处的吸光度值的最大值分别为60.4和56.4；而在图3b中，补充葡萄糖和蔗糖时，酶活性的最大值分别达到了86.65 U/mL和61.86 U/mL。由此可见，碳源的

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