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摘 要

以微生物降解为基础的生物修复技术是消除环境中亚硝酸盐的有效办法。本课题从河边污泥中分离得到一株亚硝酸盐降解菌，并对该菌进行了形态学和分子鉴定，确定该菌为真菌，属于Daldinia属，命名为 Daldinia sp. HYTC-TB2。另外还对该菌株的亚硝酸盐耐受性、培养基中的亚硝酸盐的降解率以及菌体粗蛋白的酶活进行了测试。结果表明，在固体平板上该菌对亚硝酸钠的耐受性达30 g·L^-1；在发酵培养基中，培养6 d亚硝酸盐降解率达到100%；其粗提取胞内酶活性达到5.6 U·mg^-1总蛋白。表明该菌株对亚硝酸盐具有较强的降解效果。

关键词：真菌，亚硝酸盐降解，亚硝酸盐还原酶

Abstract：Bioremediation based on microbial degradation is an effective way to eliminate nitrite in the environment. A nitrite degrading bacterium was isolated from the sludge of the river, and the strain was identified by morphology and molecular identification, which was fungus, belonged to Daldinia, and named as Daldinia sp. HYTC-TB2. The nitrite tolerance, degradation rate of nitrite in culture medium and enzyme activity of crude protein of the fungus were tested. The results show that the nitrite tolerance was 30 g/L, the nitrite degradation rate reached 100% after 6 d′s fermentation, the crude intracellular enzyme activity reached 5.6 U·mg^-1 total protein. All of the tests above indicated that the strain can degrade the nitrite efficiently.

Keywords：Fungi, nitrite degradation, nitrite reductase

目录

1 前言 3

1.1 亚硝酸盐的产生 3

1.2 亚硝酸盐的作用 3

1.3 亚硝酸盐的危害 3

1.4 降解亚硝酸盐的研究进展 4

2 试验材料与方法 5

2.1 试验材料 5

2.1.1 试验菌种 5

2.1.2 培养基 5

2.1.3 试验试剂及配制 5

2.1.4 试验仪器及设备 6

2.2 试验方法 6

2.2.1 菌株的分离筛选 6

2.2.2 菌株的形态学鉴定 6

2.2.3 Daldinia sp. HYTC-TB2在平板上对亚硝酸钠的耐受性测试 7

2.2.4 液体培养基中亚硝酸钠的降解率测试 7

2.2.5 亚硝酸盐还原酶活的测定 7

3 试验结果与分析 8

3.1 Daldinia sp. HYTC-TB2对亚硝酸钠的耐受性 8

3.2 Daldinia sp. HYTC-TB2对亚硝酸钠的降解率 8

3.2.1 亚硝酸钠的标准曲线 8

3.2.2 Daldinia sp. HYTC-TB2的降解率 9

3.3 亚硝酸还原酶活性 9

结 论 11

参 考 文 献 12

致 谢 14

1 前言

亚硝酸盐，一类无机化合物的总称。主要指亚硝酸钠，亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水^[1]。

1.1 亚硝酸盐的产生

亚硝酸盐是氮循环中无机结合氮的一种分子形态，普遍存在于农田耕地、植物、湖水池塘当中^[2,3]。在农业方面，我国现阶段能够促进农作物的质量、产量和生产效率显著提高的技术水平一般都是通过对农作物使用氮肥。随着经济及科技水平的发展，市场上出现各种各样的氮肥。农田土壤施撒氮肥，虽然能够提高农作物的产量、质量及生产效率，但氮肥大量的使用也会导致严重的土壤污染问题^[4]。氮肥在农田中大量的施撒，使得硝酸盐和亚硝酸盐在农田土壤中大量的堆积，导致农作物、食品以及饲料中残留大量的亚硝酸盐。

1.2 亚硝酸盐的作用

亚硝酸盐是肉制品中常用的食品添加剂，在食品腌制的过程中也具有非常重要的作用。① 润色作用^[5]：硝酸盐在肉制品发酵历程中，硝酸盐通过还原微生物被还原成亚硝酸盐，在肉中酸性环境下亚硝酸盐被酸化为亚硝酸最后成为NO，肉制品中的肌红蛋白和血红蛋白与亚硝酸作用，形成了具有色彩鲜红的亚硝基肌红蛋白和亚硝基血红蛋白，在对肉制品进行加热时，高温使肉制品中亚硝基血红蛋白的巯基(-SH)脱离，形成具有鲜红色的亚硝基色朊，让肉制品产生诱人的色泽；② 抑菌及防腐作用^[6]：硝酸盐和亚硝酸盐具有控制制微生物繁殖的作用，尤其是对控制肉毒梭菌的繁殖具有很好的作用，以至于减少或消除肉毒梭菌分泌的肉毒毒素会造成的食物中毒等问题，与此同时也形成了良好的防腐作用；③ 增强风味^[7]：在肉制品中加硝酸盐还能够改善风味，提高肉品的作用，使肉制品拥有良好的弹性，口感良好，清除原料肉中的异味，提高肉制品品质。

1.3 亚硝酸盐的危害

亚硝酸盐是氮循环中无机结合氮的一种分子形态，其氮处于中间价态，酸性条件下具有较强的氧化性，在血液中血红蛋白可被亚硝酸盐氧化为高铁血红蛋白，从而降低高等动物体内氧的运输能力。在体外，用亚硝酸钠处理人红细胞后，会引发红细胞中酶和非酶介导的氧化应激，导致血红蛋白失活聚集，脂质和蛋白质被氧化，且红细胞内的主要代谢途径亦发生改变。当人误食摄入亚硝酸盐的量达到0.3-0.5 g以上时，就有可能引起人身体不适，甚至亚硝酸盐中毒，出现中毒症状，中毒症状主要表现为头痛，头晕，无力，胸闷，气短，心悸，恶心，吐逆，腹痛，腹泻，腹胀满身皮肤及粘膜泛起深浅不同的青紫色，严重者呈现烦燥不安，精力萎靡，反应缓慢，意识缺失，惊厥，昏厥，呼吸下降乃至死亡^[8]。危害更大的是，误食亚硝酸盐被人体吸收后，在一定条件影响下，亚硝酸盐能够与脂类、酰胺类化合物反应生成亚硝胺，是一种强致癌物，对身体造成巨大危害^[9,10]。我国食品卫生标准(GB2760-2011)中限定亚硝酸盐在肉类罐头和腌制罐头类食物中亚硝酸盐的量不能超过50 mg·kg^-1(以NaNO₂计)；在蒸煮、烟熏火腿及罐头、火腿罐头中的最终剩余量不得超过70 mg·kg^-1：腌制食品不能超过20 mg·kg^-1。

1.4 降解亚硝酸盐的研究进展

自然界可利用生物类群对被污染的环境，如亚硝酸盐污染，研究者利用具有亚硝酸盐降解能力的微生物来解决污染问题。目前已有很多研究者分离出了具有亚硝酸盐降解能力的微生物。如单晓丽^[11]利用微生物学基本分离方法，从土壤中分离出了具有亚硝酸盐降解能力的地衣芽孢杆菌FS¬2、FS¬3，并且进行了以这两种菌作为泡菜中的添加菌，进行亚硝酸盐降解实验。生物体可利用体内产生的亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase，NiR）把亚硝酸盐还原为一氧化氮或氨。NiR普遍存在于植物和微生物中，海内外的试验者们已经从植物、红藻、细菌中分离并提纯到亚硝酸盐还原酶。刘萍等^[12]经(NH₄)₂SO₄分级沉淀、DEAE-Cellulose柱层析、SephadexG-75凝胶过滤层析等方式分离并提纯到亚硝酸还原酶，并发现其分子量为35 kD，最适温度和pH分别为40℃和6.5。早在1960s，Alcaligenes sp.，Neurospora crassa，Pseudomonas sp.等亚硝酸盐降解菌就从污水中被分离出来了。但关于能降解亚硝酸盐的真菌的研究起步较晚，1995年，Kobayashi, M等^[13]首次从真菌Fusarium oxysporum中分离出NiR，后有多种真菌的Cu-NiRs被报道。杜婵娟等^[14]以亚硝酸钠为唯一氮源，从土壤中筛选出产亚硝酸还原酶的真菌，并提取其胞内酶进行酶学研究，研究表明，其胞内酶受EDTA、Ni² 、Co² 抑制，但Ba² 却具有激活作用，酶活最适反应温度和pH分别为35℃和7.4。

目前关于亚硝酸盐还原酶及亚硝酸盐降解菌的应用主要在生物传感器、水体修复、食品保鲜等方面^[15,16]。其中水体养殖中亚硝酸盐还原酶及亚硝酸盐降解菌的应用比较广泛，但已报道的该类酶或菌株的适用条件为弱酸性、温度大于30℃，限制了其应用^[17]。本研究提供一株亚硝酸盐降解菌及其在亚硝酸盐降解中的应用，从河边污泥中筛选出具有较高亚硝酸盐耐受性及较高降解活性的真菌新种，高效安全，发挥在环境修复方面的独特优势，解决水体修复等问题。

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验菌种

真菌Daldinia sp. HYTC-TB2由本研究所分离纯化并保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学。

2.1.2 培养基

⑴查氏平板筛选培养基：

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