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摘 要

：随着转基因技术的快速发展，转基因产品逐渐市场化，转基因产品的安全性也受到越来越多的关注，对于转基因产品而言，建立相应的监管制度和检测标准尤为重要。本研究以冬小麦为研究材料，分别使用定性和荧光定量PCR对待测样品中的常用外源基因NOS终止子进行检测分析，来判断该样品是否为转基因产品。

关键词：冬小麦；外源基因；PCR技术

Abstract: With the rapid development of transgenic technology and transgenic products market gradually, more and more people pay attention to the safety of genetically modified products , for the GM products, establish the corresponding supervision system and testing standard is particularly important. In this research, we use winter wheat as material, qualitative and fluorescence quantitative PCR to detect exogenous gene NOS terminator, to determine whether the samples for genetically modified products.

Keywords: winter wheat; foreign gene; PCR

目录

1前言 5

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.2 试剂与耗材 5

2.3 仪器设备 5

2.4 方法 6

2.4.1 DNA的提取与纯化 6

2.4.2引物及探针序列 6

2.4.3 PCR检测 7

3结果分析 8

3.1 DNA提取结果 8

3.2定性PCR检测 9

3.3荧光定量PCR检测 9

结论 11

参考文献 12

致谢 13

1 前言

转基因生物（Genetically Modified Organism，简称GMO）是指利用现代生物技术，将特定的外源基因导入到受体生物中，是受体生物获得某种特定的性状，这种携带外源基因的生物称为转基因生物^[1]。以转基因生物为原材料加工的食品称为转基因食品（Genetically Modified Foods，简称GMF）^[2]。目前，转基因技术被广泛应用于农作物的改良，主要包括对小麦、水稻、油菜、玉米等的抗虫抗逆性改良^[3]。近年来，随着转基因技术的不断发展，转基因产品也逐渐商业化，与此同时，转基因作物，特别是转基因食品的安全性也引起了广泛关注。

目前，大家较为关心的是大量应用转基因生物是否会破坏生物多样性，转基因食品是否对人类的健康造成伤害。真对这一现状，世界各国分别制定了相应的安全标准，并研发了不同的检测方法。近年来，关于转基因检测的报道较多，例如：许爽等使用定性PCR技术对含有卡纳霉素的8个番茄品种进行转基因检测^[4]，王颖等应用PCR技术检测饲料中的外源基因成分^[5]，这些检测方法不仅可以有效的检测外源基因，同时也为受体植物的研究提供了可靠的依据^[6]。许芳等通过对市场常见玉米产品检测，发现市场上确实存在未经标识的转基因产品，这为有关部门对转基因的监管提供了依据^[7]。

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)的简称。是利用核酸复制酶、引物和核酸单体组成元件，在体外完成模板DNA的复制^[8]。PCR技术有特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好等优点^[9]。本实验以冬小麦为材料，分别使用定性和定量PCR检测方法判断待测样品中是否含有外源基因NOS终止子。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有NOS终止子基因）和待测样品由中国农业科学院国家检测中心提供，阴性常规种由淮阴师范学院刘乃森老师提供。

2.2 试剂与耗材

定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR所用2× GoldStar TaqMan Mixture(with ROX)、电泳液和Lodding Buffer由自己配制、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化

本研究使用改进的CTAB法对小麦基因组总DNA进行抽提，实验步骤如下：

（1）将小麦颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0. 2 g粉末装入 2mL离心管中。

（2）立即加入600μl已经预热到65℃的2×CTAB，混合均匀。

（3）将离心管转入65℃水浴，温浴40min，温浴过程中颠倒混匀数次。

（4）加入等体积（600μl）的氯仿:异丙醇（24:1）。

（5）颠倒混匀30分钟，室温4000rpm离心20分钟。

（6）取上清（约500μl）于新的1.5ml离心管中，加入等体积（500μl）的酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）。

（7）颠倒混匀5分钟，室温4000rpm离心20分钟。

（8）取上清（约400μl）于新的1.5ml离心管中，加入200μl含有RNA酶的1M NaCl溶液。

（9）加入2/3体积（400μl）已预冷的异丙醇，混匀，—20℃放置30分钟，或更长或过夜沉淀DNA。

（10）4000rpm离心10分钟，弃上清，在吸水纸上放置1分钟，吸干水。

（11）加入500μl75％的乙醇清洗DNA，洗涤至少20分钟，4000rpm离心10分钟，弃上清。

（12）重复步骤11，弃上清后置于超净台吹干。

（13）用100μl的超纯水溶解DNA，—20℃储存备用

2.4.2引物及探针序列

本研究使用的引物和探针是国家转基因检测标准使用的引物和探针，本实验通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，其序列详见下表。

2.4.3 PCR检测

（1）定性PCR扩增

PCR又称聚合酶链式反应，是一种体外扩增技术，在引物、模板DNA和核苷酸存在的条件下，进行酶促反应，使特定的DNA片段在数量上呈指数增加的技术，该技术能在短时间内获得大量的特定基因片段。 本研究根据实验室的一贯实验习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，具体反应体系如下：

按照上述反应体系设两个对照实验。以含有目标基因的质粒作阳性对照，以水作空白对照，反应体系配制完成后置于ABI公司生产的GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行PCR扩增，根据引物退火温度及扩增片段的大小设定扩增反应条件，详见表4。

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