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摘 要

目的：研究改性壳聚糖促进巨噬细胞分泌细胞因子的调节机制。方法：本实验使用RAW264.7进行体外实验，利用Griess法检测RAW264.7分泌的NO量；用MTT法检测改性壳聚糖对RAW264.7细胞活性的影响；RT-PCR检测IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS的mRNA表达水平；蛋白印迹法检测TNF-α、COX-2、iNOS的蛋白表达量。结果：改性壳聚糖对RAW264.7无明显细胞毒性；促进其释放炎症因子的最佳作用浓度为100 μg/mL，反应最佳时间为180分钟。结论：改性壳聚糖能够促进巨噬细胞分泌细胞因子，参与免疫应答。

关键词：改性壳聚糖，RAW264.7，细胞因子，MTT，NO，RT-PCR，蛋白印迹

Abstract: Objective: The aim of this study was to investigate study the regulatory mechanism of modified chitosan on the secretion of cytokines on RAW 264.7macrophages. Methods: In this experiment, RAW264.7 was used for in vitro experiments. The amount of NO secreted by RAW264.7 was detected by Griess method. The cytotoxicity of modified chitosan on RAW264.7 activity was determined by MTT assay. The mRNA levels of IL-1β, TNF-α, COX-2 and iNOS were investigated by RT-PCR. The protein expression of TNF-α, COX-2 and iNOS were detected by Western blotting. Results: Modified chitosan has no obvious cytotoxicity to RAW264.7. The best concentration for its release of inflammatory factors is 100 μg/mL, and the optimal reaction time is 180 min. Conclusion: Modified chitosan can promote macrophages to secrete cytokines and participate in immune responses.

Keywords: Modified chitosan, RAW264.7, Cytokines, MTT, NO, RT-PCR, Western blot

缩略语注释

缩略语	英文名称	中文名称
mRNA	Messenger ribonucleic acid	信使核糖核酸
MTT	(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide	噻唑蓝
RT-PCR	Reverse transcription polymerase chain reaction	逆转录聚合酶链式反应
PBS	Phosphate buffered saline	磷酸盐缓冲液
SDS	Sodium dodecyl sulfate	十二烷基硫酸钠
DTT	DL-Dithiothreitol	二硫苏糖醇

目录

第一章 引言 4

1.1 多糖来源及研究现状 4

1.2 免疫调节的研究现状 4

1.3 壳聚糖的生物活性及研究现状 5

1.4 本研究的目的及意义 5

第二章 实验材料及仪器 7

2.1 实验细胞株 7

2.2 主要实验试剂及溶液配制 7

2.3 主要仪器及设备 7

第三章 实验方法 7

3.1 冻存细胞的复苏 7

3.2 细胞继代培养 8

3.3 细胞计数 8

3.4 MTT毒性实验 8

3.5 NO浓度的测定 9

3.6 RT-PCR 9

3.7 蛋白印迹法 10

第四章 实验结果 12

4.1 MTT实验结果 12

4.2 NO测定结果 13

4.3 RT-PCR实验结果 14

4.4 蛋白印迹结果 15

结论 17

致谢 18

参考文献 19

引言

1.1 多糖来源及研究现状

多糖是一类来源于天然的结构多样的大分子，多糖会影响多种生物反应，其中免疫反应受影响尤为明显。多糖的来源也很广泛，主要来自于植物、真菌、动物，但在目前已有的文献和研究中，研究动物多糖的并不广泛^[1]。大多数来自高等植物的多糖是无毒的，不会产生明显的副作用，这与细菌多糖和合成化合物有关，植物多糖被认为是低毒的有效生物反应改性剂。例如已有文献报道，白花蛇舌草多糖具有重要的抗肿瘤和免疫调节作用^[2]。

多糖既是一种重要的生命组成成分，同时它还具有多种生物活性功能，比如其具有减少炎症反应和对免疫系统的调节等功能，它的抗肿瘤、降血糖和降胆固醇等多种作用也是不可忽视的^[3]。当神经细胞受到自由基诱导后产生的细胞毒性伤害时，多糖能够有效地阻止和保护细胞从而促进甾体生成^[4]，来源于真菌菌丝体中分离出的多糖在一定程度上能够抗氧化。

迄今为止，关于多糖研究的报道已经有很多，对于多糖的了解也越来越深入。茶叶多糖因为具有增加免疫的作用可以辅助治疗糖尿病；刺五加多糖因能激活网状内皮系统^[5]，从而具有代谢老化细胞和吞噬异物的作用；芦荟多糖因为可能影响抗攻击因子，具有抗溃疡的作用；硫酸化多糖能够抑制逆转录酶活性，被认为可以抗艾滋病毒；黄芪多糖能够影响炎症因子释放从而调节免疫应答；香菇多糖会显著地阻碍癌细胞的生长具有抗癌作用。

1.2 免疫调节的研究现状

在免疫系统中，巨噬细胞具有不可替代的地位，它遍布于大多数组织和器官中， 除了主要存在于淋巴器官外，还存在于身体其他部位。巨噬细胞可以通过吞噬外来抗原和分泌促炎因子直接杀死病原体两种方式参与免疫反应。在先天免疫和适应性免疫之间，巨噬细胞发挥着独特的作用，它负责向抗原特异性T细胞的递呈以及抗原的处理^[6]。巨噬细胞的活化，可诱导其表达出辅助性和共刺激分子，与T细胞产生刺激，促进其进行持续相互作用，进而产生适应性免疫作用。本质上，上述过程是免疫刺激的基本机理。研究表明植物多糖通过免疫细胞的激活作用，具有抗肿瘤、杀菌和其他等多种治疗作用。巨噬细胞被认为是某些抗肿瘤和免疫调节药物的重要靶细胞^[7]。

在我们的身体中，经常会发生炎症反应，这是身体机能为了有效地抑制真菌、病毒等所产生的感染，来保护身体机能。巨噬细胞不仅仅能够参与天然免疫应答，还能产生效应细胞对抗感染和炎症。在宿主防御系统中，巨噬细胞分泌炎症因子产生炎症反应是尤为重要的免疫反应。

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