论文总字数：16213字

摘 要

Dof（DNA-binding one zinc finge）基因家族是锌指卵白超家族的亚家族的一员，它属于植物中特有的一类转录因子。Dof基因家族在植物的茎、根、叶、果实成熟以及花的发育中都有一定的作用，特别是在植物抗逆过程当中扮演十分重要的角色。本文通过生物信息学方法，以短柄草基因组数据为基础，鉴定了短柄草Dof家族基因，对短柄草Dof家族基因的保守域和系统发育关系进行了详细分析，并对比了短柄草与水稻、拟南芥、玉米等多个物种中Dof家族基因家族，进一步分析五种植物间的同源性关系。经研究表明：Dof家族基因均有着高度保守结构域，显示短柄草和其他的物种之间有大量的同源基因，从而为进一步研究植物Dof家族基因家族的结构与功能提供帮助。

关键词： Dof家族基因，短柄草，转录因子，进化分析

Abstract: The Dof（DNA-binding one zinc finge） gene family is a member of the subfamily of zinc finger super-family, a unique transcription factor in plants. The Dof family of genes plays a role in plant stems, roots, leaves, fruit ripening, and flower development, especially in the process of plant stress resistance. Based on the bioinformatics method, the Dof family gene of Brachypodium distachyon was identified on the basis of the genomic data of the short stalks. A detailed analysis of the conserved domains and phylogenetic relationships of the Dof family genes in Brachypodium distachyon was conducted. Brachypodium distachyon and rice, Arabidopsis thaliana and maize are compared. The Dof family of genes in several species was further analyzed for homology between the five plants. Studies have shown that the Dof family genes have highly conserved domains, indicating that there are a large number of homologous genes between Brachypodium distachyon and other species, thus providing further help for the study of the structure and function of plant Dof family gene families.

Keywords: Dof family genes, Brachypodium distachyon, transcription factor, evolutionary analysis

目 录

1 前言 6

1.1 Dof转录因子 6

1.1.1 Dof转录因子的结构 6

1.1.2 Dof转录因子的核心识别序列 8

1.1.3 Dof转录因子的数目 8

1.1.4 Dof 转录因子的生物学功能 8

1.1.4.1 Dof 转录因子响应光系统和参与代谢调节 8

1.1.4.2 Dof转录因子参与种子成熟调控 9

1.1.4.3 Dof转录因子参与植物防卫机制和应答植物激素基因 9

1.2 短柄草的生物学研究概述 9

1.3 研究目的与意义 9

2 材料与方法 10

2.1 植物Dof转录因子数据获取与鉴定 10

2.2 Dof保守序列的鉴定和分析 10

2.3 多序列联配、蛋白质保守序列对比和系统进化树的构建 11

2.4 Dof基因家族在不同物种中染色体区段的复制分析 11

3 结果与分析 11

3.1 短柄草Dof 转录因子家族的鉴定 11

3.2 Dof 转录因子家族的进化分析 13

3.3 短柄草Dof转录因子的保守基序分析 15

3.4 短柄草Dof转录因子家族所在染色体区段复制分析 16

3.5 Dof转录因子家族在短柄草和水稻、短柄草和玉米之间染色体区段复制分析 17

结 论 19

致 谢 23

1 前言

转录因子是植物转录调控中的重要因子，这些调控包括调节植物生长发育、介入信号转导和应答环境胁迫响应等，因此有多种转录因子存在于植物中^[1]。转录因子是一组蛋白质分子，其可以确保目的基因在某个特殊的空间和时间中以某种特定的强度表达^[2]，同时，又称反式作用因子。转录因子的表达丰度不高，即其转录成mRNA的数量不多，它的家族成员DNA结合序列相对保守。

一个植物转录因子的结构含有DNA联合结构域、转录调控结构域、核定位信号区和寡聚化位点等4个功能区^[1]。DNA联合结构域，多由60-100个氨基酸构成，在这个区域，转录因子辨认顺式作用元件并与之毗连。转录调控结构域由激活区和抑制区两类构成，用于激活或妨碍相关基因的表达。寡聚位点用于多个转录因子的相互作用。在这一功能区，它们的氨基酸序列是保守的，并且它们中的大部分与结合域连接从而形成一定的空间结构。核定位信号是一种信号肽，在植物转录因子中是随机散布的。在该区域中，赖氨酸和精氨酸残基的含量非常丰富。在一个转录因子中可能包含不止一个核定位信号。其中转录因子进入细胞核的过程则受到核定位信号区域的控制调节。

转录因子依据其作用特点可以分为两种类型，其中一类是组成型表达类型转录因子，这种类型的因子在细胞的整个生命周期中能够普遍表达；另一类为条件诱导型表达转录因子，需要在特定的时期和环境下才能激活表达，其中条件型转录因子又可分为组织特异性转录因子和信号诱导型转录因子^[3]。依据它们的结构特征，转录因子可以分为几种不一样的基因家族，如bHLH （碱性螺旋-环-螺旋）转录因子家族、TCP 转录因子家族和Dof转录因子家族等^[4]。

1.1 Dof转录因子

Dof转录因子家族正常是由 200-400个氨基酸构成的，它是锌指蛋白超家族的亚家族的一员^[6]。由于在它的单锌指保守结构域中Cys残基含量丰富，因此将其命名为 Dof 结构域^[1]。Dof基因家族在植物中属于特殊的家族^[5]。

1.1.1 Dof转录因子的结构

Dof转录因子有二个功能结构的区域：一个是DNA结合结构域，在此功能区中，该结构域表现为高度保守，并且这个功能结构域位于N-末尾；另一个是位于C-末尾的调控结构域，在此功能区中的氨基酸序列多变^[7]。此外，以上两个功能结构域是通过一个丝氨酸骨架作为分子铰链来结合的^[8]。

图1、 Dof蛋白结构示意图

C2-C2型单锌指结构域位于Dof转录因子的N末端的DNA结合域。该结构域是由52个相对保守的氨基酸残基构成的。一个Zn² 在这种单锌指结构中可以共价连接4个Cys 残基^[9](见图2)。Cys残基和Zn² 的存在影响了Dof蛋白的活性，其中Cys残基的任何取代和二价离子鳌合剂的存在将导致Dof蛋白的生物活性丧失，通过 Dof 蛋白与DNA 相互作用的不断探索可以证实该结论^[10]。Dof转录因子的转录调控结构域出现在C端的末尾，影响与序列的特殊连接。例如，大麦的BPBF转录因子的转录调控结构域出现在C端末尾。该结构域的氨基酸序列的保守性不高、多变性是导致植物Dof转录因子功能多样性的原因之一^[11]。

图2、 Dof蛋白C2-C2结构模式图

注:高度保守的C2-C2结构在图中以深灰色表示，在已知的Dof蛋白中一致保守的氨基酸用黑色表示，高度保守的氨基酸和其余可变的氨基酸分别用深蓝色和灰色表示。

1.1.2 Dof转录因子的核心识别序列

一般植物的Dof 转录因子识别的核心序列是（A/T）AAAG^{[8, 12-14]}，但是南瓜的 Dof蛋白 AOBP比较特殊，它的识别序列是AGTA^[15]。核心识别序列中氨基酸高度保守。在核心序列中，碱基发生突变以及核心识别序列的数量的多少都会影响 Dof 转录因子与它的特异性结合。然而碱基突变并不会对核心序列的侧翼序列对的结合能力产生影响^[16]。

1.1.3 Dof转录因子的数目

在1993年，玉米的Dof 转录因子-ZmDof1（MNB1）蛋白被Yanagisawa^[17] 等第一次在其分子实验中检测出，随后在单子叶和双子叶植物中，Dof基因的数目得以揭示。例如水稻^[18]、大豆^[19]、大麦^[20]、小麦^[21]、高粱^[22]、拟南芥^[23]的Dof基因的数目分别为有30、79、26、26、28、36个 。

1.1.4 Dof 转录因子的生物学功能

Dof蛋白结合元件存在于启动子中且Dof转录因子的功能具有多样性，这些表明了Dof转录因子介入并调节植物体内多种生物活性的进程。Dof转录因子参与植物的特有生理过程，其中这些过程包括碳和氮的代谢、组织分化、种子的发育调控、胁迫响应、响应植物激素等等^[24]。

1.1.4.1 Dof 转录因子响应光系统和参与代谢调节

植物的Dof转录因子操纵控制与代谢有关的基因的表达改变植物的代谢进程，从而使植物的生长发育发生不一样的变化。甘薯贮藏根中的碳代谢是红薯Dof转录因子SRF1通过抑制液泡中的反转录酶的基因Ibbfruct2的表达来调控的^[5]；C4玉米中的Dofl和Dof2主要利用调节植物光合作用中存在的PEPC基因的表达来调节代谢^[25]；氮被称为生命的元素，Dof转录因子不仅可以调控碳类代谢，还可以调控氮代谢，提高植物的氮利用率。在低氮条件下，TaDof1基因通过控制谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶的表达，影响了氮代谢，进而提高了小麦的氮素利用率；在松树的发育过程中，氨同化是通过与GS基因结合的松树的PpDof5转录因子来调节^[26]。光是植物生长的能量来源，Dof转录因子介入光响应，能够调理光敏色素基因的表达。例如在拟南芥中，光敏信号是利用光敏色素 A( PhyA )和光敏色素 B( PhyB )对Dof转录因子 COG1的负调控^[27]。

1.1.4.2 Dof转录因子参与种子成熟调控

Dof 转录因子在种子的生长过程中起着关键作用。它可以控制种子萌发与成熟，调控种子贮藏蛋白的表达。例如，拟南芥Dof6通过调节与代谢有关的ABA基因的表达，影响拟南芥的萌发过程^[28]；在大豆中，它的转录因子 GmDof4和GmDof11通过与贮藏蛋白基因CRA1的启动子的结合而抑制表达, 进而降低种子中的蛋白含量^[29]。

1.1.4.3 Dof转录因子参与植物防卫机制和应答植物激素基因

Dof转录因子能够参与植物对激素的应答。其中植物生长激素包括生长素、细胞分裂素等。在顶端分生组织和微管中，烟草中 Dof 转录因子 NtBBF1与根尖分生组织和微管中致癌基因rolB的启动子结合并特异性表达，在生长素的引诱下，促进根的生长^[30]。Dof 转录因子参与调节防御反应相关基因的表达，例如拟南芥Dof转录因子 OBP1可以在氧化胁迫信号引诱下或者水杨酸存在的条件下调节植物防御基因表达^[31]。

1.2 短柄草的生物学研究概述

短柄草为禾本科短柄草属植物^[32]，短柄草起源于北非和中东地区，现在在新疆、四川、陕西、江苏和甘肃省等省份呈规则分布，生于林缘、林下、落丛草地，分布于海拔1500-3600米的位置。短柄草的基因组很小，它的植株株型不大，其生长周期时间不长，但是可以自花受精，且容易被转化^[33]。它具备与麦类相似的基因组成。短柄草具有的以上优点使其为研究温带禾本科的模式物种。此外，短柄草的全基因组测序已经降低了其在基因组研究中的难度^[33]。

1.3 研究目的与意义

经过十几年来人们的不断探索, 研究者们对Dof转录因子的功能已经有了初步的了解。随着对Dof 蛋白的更深层次的研究，我们会对Dof 转录因子的生物学功能将会得到更多了解。我们对Dof 转录因子的生物学功能进行分析，这样做有助于揭示相应领域中的生理生化现象，有利于深入了解植物发育，为改良物种相关农艺性状等提供依据。生物信息学借助信息论方法和计算机等技术研究各个生物信息的表述、获得、贮存、检索、阐发以及解读，广泛应用于科学研究。生物信息学逐渐成为对生物数据处理与阐发必不可少的重要工具，并且也将进一步为后续的实验作为指导。

本试验利用生物信息学的方法，详细地分析了短柄草Dof家族基因的保守结构域、系统进化关系，并对比了短柄草与水稻、拟南芥、玉米、高粱等多个物种中Dof家族基因家族，进一步分析五种物种间的同源性关系。另外，通过分析短柄草Dof基因在不同组织中的表达情况，揭示单子叶植物Dof转录因子的功能机制，进而比较单子叶和双子叶植物Dof转录因子的功能及分化模式的异同有重要意义^[3]，从而为该基因的生理功能提供线索。

2 材料与方法

2.1 植物Dof转录因子数据获取与鉴定

本论文研究内容的数据均通过数据库获取，具体数据获取步骤如下：首先从短柄草基因组数据库（TIGR）中下载短柄草全基因组序列，从而获得短柄草Dof转录因子家族序列，其次在Pfam数据库中找到水稻Dof家族独有的蛋白结构域作为模板，然后利用MEME软件搜索带有独特结构域的序列^[34]。再然后用SMART程序检测去掉不包含目标结构域的序列，最后得到短柄草Dof转录因子家族的序列^[35]。采用同样的方法，完成对含有Dof特殊结构域的序列的筛选，除去没有独特结构的序列，就可以得到包含有Dof家族的全部序列。

在TIGR基因组数据库中下载短柄草全基因组数据库，利用上文提到的Pfam方法在短柄草中检测是否存在此家族蛋白的特征结构域，借助同样的方法从而完成对含有Dof特殊结构域的序列筛选，除去没有独特结构的序列，即可得到包含有Dof家族的全部序列^[35]。利用ExPASy蛋白质信息数据库（http://www.expasy.org/）对短柄草Dof蛋白的染色体位置、分子量、等电点等基本信息进行了分析^[36]。

玉米和高粱等的Dof基因序列获得的方法和短柄草Dof基因序列的获取过程一样，按基因号可在TFDB数据库中查询便可得到^[37]，然后对数据进行整合，从RGAP数据库中获取目标转录因子的CDS序列，每个基因号对应不同的CDS序列。在KOME数据库中获得各自相对应的Dof基因序列号，并进行数据整合并用于后期的数据分析和处理。

2.2 Dof保守序列的鉴定和分析

Dof转录因子家族含有一段特别的保守结构域，通过在线搜索程序MEME (http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi) 查找并分析Dof蛋白质中的保守结构域，即保守基序，并将参数设置成“any”，设定这些基序的长度为0-50，预期存在10个基序^[38]。

2.3多序列联配、蛋白质保守序列对比和系统进化树的构建

首先，我们对Dof家族特殊保守结构域的氨基酸进行了多序列联配分析，应用Cluster软件分析所得结果，随后借助Mega程序(http://www.megasoftware.net/)对短柄草Dof保守结构域作进一步的分析，将Bootstrap的值设定成1000^[39]。将Mega程序分析的结果借助WebLogo软件进行直观性的图示化，即可验证转录因子保守域的分析内容。依照短柄草Dof特殊结构域分析的方法和步骤，采用邻接法绘画出水稻、短柄草、拟南芥、玉米和高粱中该家族的系统进化树^[40]，对比单独分析短柄草中Dof家族系统发育树，我们发现在不同物种间，Dof家族可以得到九个亚家族分类，图中不同物种用不同颜色不同形状标记。

2.4 Dof基因家族在不同物种中染色体区段的复制分析

借助于PGDD (http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)分析所选的Dof基因各自所在染色体区段的线性复制情况^[41]，将所有存在染色体复制关系的数据进行整理，借助染色体定位软件MapInspect完成图示化结果展示；按照上述方法将短柄草与水稻、短柄草与玉米之间的Dof基因进行线性复制关系分析，为了更好地展示，这次将得到的结果借助Circos软件进行图示化^[42]，便可直观地看出所需检测的染色体之间的同源性关系。

3 结果与分析

3.1 短柄草Dof 转录因子家族的鉴定

在短柄草基因组数据库中共发现 29个Dof转录因子（见表1）。其中等电点范围为4.6839~10.2722，最短的序列有 193个氨基酸残基，最长的序列有 549个氨基酸残基。在Web Logo图中序列中氨基酸的堆积高度指示了该位点的保守程度，并且堆叠中的单个氨基酸的高度显示了该位置处氨基酸的相对频率。根据Web Logo图得出结论，29 个Dof 转录因子均含有典型的 α 螺旋结构，并且氨基酸残基 Trp(W)-39 、Cys(C)-7、Cys(C)-10、Cys(C)-18、Cys(C)-32和 Cys(C)-35 在这些序列中高度保守（见图3）。

表1 短柄草Dof 转录因子家族基因基本信息

序号	基因号	蛋白大小	分子量(MW)	等电点(PI)	染色体位置(Mb)
	Bradi1g03710.2	462	46386.4	9.2729	C1-2.40
	Bradi1g07600.1	389	40302.5	9.606	C1-5.33
	Bradi1g14570.2	281	29292	9.6212	C1-11.43
	Bradi1g15420.2	391	40782.3	8.8262	C1-12.24
	Bradi1g17410.1	444	47670.5	8.0819	C1-13.94
	Bradi1g26570.1	357	35851.4	8.0095	C1-21.62
	Bradi1g66597.1	409	42151.6	9.8406	C1-65.53
	Bradi1g73710.1	435	47190.7	8.1988	C1-71.38
	Bradi2g05794.1	243	25263	9.3134	C2-4.21
	Bradi2g09720.1	549	59270.1	4.6839	C2-7.88
	Bradi2g10640.1	488	53276.2	7.2977	C2-8.77
	Bradi2g19930.1	205	21836.6	9.5605	C2-17.53
	Bradi2g24040.1	328	34410.3	7.673	C2-21.70
	Bradi2g37130.1	371	39324.7	8.8554	C2-37.44
	Bradi2g50370.1	193	20700.2	10.2722	C2-50.11
	Bradi2g55980.1	356	37435.3	4.7797	C2-54.22
	Bradi2g62380.2	347	36363.9	8.5765	C2-58.60
	Bradi3g25670.1	437	46697.4	8.1733	C3-25.83
	Bradi3g29940.1	257	26142.1	9.3259	C3-31.73
	Bradi3g38980.1	258	26376.2	5.866	C3-41.16
	Bradi3g51510.1	367	37644.5	8.5867	C3-52.29
	Bradi3g52880.1	319	33780.2	8.2367	C3-53.65
	Bradi3g56380.1	273	28120.1	7.9051	C3-56.25
	Bradi4g04260.2	376	39091.1	8.5087	C4-3.40
	Bradi4g33000.1	204	21835.1	8.3569	C4-38.80
	Bradi4g45222.2	321	34060.3	6.3848	C4-48.38
	Bradi4g45224.2	227	23905.2	8.7531	C4-48.39
	Bradi5g18640.1	380	39063.4	8.5861	C5-21.71
	Bradi5g26240.1	218	22370.5	7.3687	C5-27.49

图3 、Dof家族特征结构域在短柄草中的保守性分析

3.2 Dof 转录因子家族的进化分析

为了解短柄草Dof转录因子家族成员的进化关系，以短柄草Dof 蛋白的保守域序列构建了系统进化树。从结果可以看出，短柄草Dof转录因子家族分成 5 个亚家族(Ⅰ~Ⅴ)(见图4)，其中亚家族Ⅰ、Ⅱ在亲缘关系上更为相近。在水稻、玉米、拟南芥、短柄草以及高粱等 5个物种中，将 Dof转录因子家族分成 9个亚家族(Ⅰ~Ⅸ) (见图5)。短柄草和其他植物中的 Dof家族基因并非独立进化，而是每个亚家族都同时含有短柄草和其他植物中的 Dof 成员，并且每个亚家族的成员具有相似的结构域。由此表明在水稻、高粱、拟南芥和二穗短柄草等物种分化之前，这些 Dof 基因已在同一物种中发生了分化。此外，从亚科的基因分布来看,Ⅸ亚科的基因数远多于其他亚科。

利用邻域连接方法推导出了演化历史。我们bootstrap值设置为1000，它代表了分类单元的进化历史。在不到50%的引导复制中复制的分区对应的分支会崩溃。在bootstrap测试(1000个复制)中，将相关的分类聚集在一起的复制树的百分比显示在分支的旁边。进化的距离是用不同方法的数量来计算的，每个序列中氨基酸的数量是不同的单位。该分析涉及27个氨基酸序列，每个序列对都删除了所有不明确的位置。最终数据集总共有603个位置，在MEGA程序中进行了进化分析。

图4、短柄草Dof转录因子家族的进化树分析

图5 水稻、玉米、拟南芥、短柄草和高粱中Dof 转录因子家族进化分析

注：水稻，玉米，拟南芥，短柄草，高粱五个物种的最大似然法比较结果

3.3 短柄草Dof转录因子的保守基序分析

短柄草Dof转录因子家族的基序分析显示，短柄草Dof转录因子含有 Dof 家族典型的保守基序 Motif1。短柄草Dof转录因子的基序特征与系统发育树基本一致。从图6可以看出，亚家族Ⅰ中所有蛋白均含有Motif3基序，亲缘关系更为接近的Bradi1g03710.2和Bradi2g37130.1 的C端含有Motif7 基序。

表2 利用MEME程序分析短柄草Dof的保守结构域表格

图6、短柄草Dof转录因子家族的保守基序分析

3.4 短柄草Dof转录因子家族所在染色体区段复制分析

染色体区段复制分析发现，Dof基因均分布于短柄草所有的染色体上，其中1号和2号染色体上分布的基因数最多，分别为8、9个基因。5号染色体上仅有2个基因，数量最少（图7）。此外我们还可以从图上可以看出，短柄草Dof基因在染色体上出现了成簇散布的现象。在染色体区段分析的图上，在 1 号染色体的12 Mb、2号染色体的10 Mb、60 Mb等区段位置均存在 2 个或 2 个以上基因成簇。

图7、短柄草Dof 转录因子家族在染色体上的复制分析

3.5 Dof转录因子家族在短柄草和水稻、短柄草和玉米之间染色体区段复制分析

根据Dof转录因子家族在短柄草和水稻、短柄草和玉米之间的染色体重复分析结果得到结论，短柄草中的 22 个 Dof 基因与水稻中的 Dof 基因呈线性关系(见图8)，有 24 个 Dof 基因与玉米中的 Dof 基因具有线性同源关系(见图 9)。猜测这些基因在物种进化中发生了复制、重新排列和缺失等一系列事件。

图8 Dof基因在短柄草和水稻基因组中的染色体线性复制分析

注： 水稻染色体用 R1~R12 来表现，短柄草染色体用 B1~B5来表现。复制的Dof基因用黑色连线来表现。

图9 Dof 基因在短柄草和玉米基因组中的染色体线性复制分析

注：短柄草染色体用 B1~B5来表示，玉米染色体用 M1~M10 来表示。复制的Dof基因用黑色连线来显示。

结 论

Dof转录因子在禾本科植物发育调控、信号转导和抗性响应中起着重要的作用。我们对Dof基因家族的研究不算很多，对于短柄草Dof转录因子的报道更少，从而使我们还不能够对其生物学功能全面了解。但近年来随着生物信息学技术的飞速发展，利用相关的数据库和生物学软件对Dof转录因子家族进行更加深入和全面的分析成为可能。

本论文通过对短柄草Dof转录因子全基因组分析，将其家族成员划分为五个亚家族。在同一亚家族内，每个成员的Dof蛋白序列具备类似的保守域。为了解短柄草Dof转录因子家族成员的进化关系，以短柄草Dof 蛋白的保守域序列构建了系统进化树，并构建29个短柄草Dof基因的系统发育树，得到了同样的结果。本研究对比了短柄草与水稻、拟南芥、玉米等多个物种中Dof家族基因家族，进一步分析五种植物间的同源性关系，显示短柄草和其他的物种之间有大量的同源基因。本文对Dof转录因子的研究还不全面，对于植物Dof基因家族的结构与功能还需进一步研究。

参考文献

[1] 蔡晓锋, 张余洋, 张俊红, 等. 植物Dof基因家族功能研究进展[J]. 植物生理学报, 2013(01):1-12.

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：16213字