论文总字数：8234字

摘 要

：目的 合成鬼臼毒素哌啶酸酯并且进行检测；方法 使用鬼臼毒素以及相应的哌啶甲酸通过加入高效N，N-二环乙基碳二亚胺（DCC）催化剂以及4-二甲基氨基吡啶（DMAP）脱水剂进行搅拌反应；使用玻璃层析住和硅胶板点样发分离出目标产物并且除去多余杂质；之后通过氢谱图、碳谱图以及液相色谱图来分析所得产物是否为目标化合物；结论 本次实验共合成三种鬼臼毒素哌啶酸酯纯度分别为64.93%、68.7%、70.5%，且所得产物为目标化合物。

关键词：鬼臼毒素、哌啶甲酸、鬼臼类植物

Abstract: Objective to synthesize and detect podophyllotoxin piperidine ester. Methods Podophyllotoxin and corresponding piperidine formic acid were stirred by adding high-performance N,N-dicycloethyl carbodiimide (DCC) catalyst and 4-dimethylaminopyridine (DMAP) dehydrator； the target products were separated by glass chromatography and silica gel plate spot sample,and the excess impurities were removed； then the products were analyzed by hydrogen,carbon and liquid chromatography. CONCLUSION The purity of three kinds of podophyllotoxin piperidine esters were 64.93%， 68.7% and 70.5% respectively， and the products were the target compounds.

Key words: podophyllotoxin， piperidine formic acid， podophyllous plants

目 录

1. 前言 7

1.1. 癌症的危害 7

1.2. 鬼臼毒素 7

1.3. 哌啶甲酸的功效 8

1.4. 鬼臼毒素哌啶酸酯的合成意义 8

2. 实验部分 8

2.1. 实验材料 8

2.2. 实验仪器 9

2.3. 实验方法 9

3. 结果与分析 11

3.1. 目标产物的表征数据 11

3.2. 薄层层析法分析目标产物 12

3.3. 实验过程中出现的问题 13

3.4. 展望 14

4. 结论 15

致谢 17

附录 18

前言

• 1. 癌症的危害

癌症早已不是近些年新生的严重威胁人类生命健康的疾病。最早在公元前300多年，“癌症”这一词语就出现在了西方的医学史中。虽然已经过去了多年，科学技术在飞速的发展，医疗设备设施都在不断地更新换代来保护人们的生命健康，但研究员们依旧没有研究出合适的准确地治疗癌症的方法，每一年都有许多人因癌症而死。癌症不论是在中国还是全世界都是时刻威胁着人们的严重疾病。在我国每年新增的癌症患者大约有120万人，且每年因疾病致死的人数，单单癌症就有约100万人。癌症严重威胁人类的健康和生命，已成为人类第一位的致死性病因^[1]。现有的肿瘤化学治疗药物存在疗效低、毒性大、难于吸收、价格昂贵及易于产生耐药性等缺点，因此，全球每年投入大量的人力及物力寻找和开发防治癌症的新药^[2]。

• 1. 鬼臼毒素
     1. 鬼臼毒素的资源分布

鬼臼毒素是抗肿瘤物质，表征为白色粉末状，一般是从鬼臼类植物中所提取出来^{[3] [4]}。自20世纪初鬼臼毒素(Podophyllotoxin，PPT)极好的抗肿瘤和抗病毒活性被发现以来，该化合物已经得到了广泛的研究和开发，多个以鬼臼毒素或其衍生物为主成分的药物已经被FDA批准上市^[5]。由于鬼臼毒素及衍生物的重要价值，从而的得到了众多学者的关注。鬼臼类植物在我国早已具有悠久的药用历史。鬼臼类植物隶属于小檗科，包括八角莲属（DysosmaWoodson）、足叶草属（PodophyllumL）和桃儿七属（SinopodophyllumYing），其中八角莲属和桃儿七属分别是Woodson和应俊生从足叶草属中分立出来的^[6]。除足叶草属外，我国有3属即山荷叶属、八角莲属和桃儿七属，共有12种^[7]。主要分布在西藏、甘肃等地。

• • 1. 鬼臼毒素的功效

鬼臼毒素（Podophyllotoxin，1）是一种广泛存在于鬼臼属植物——华鬼臼（又称鸡苔素）的根和茎中的木质素，它具有显著的细胞毒性及抗肿瘤活性^[8]。但是，直接使用会给人体带来许多副作用^[9]。例如外用可发生肾功能衰竭和肝脏中毒，神经系统反应发生较迟，持续时间较长；脑中毒可表现为接触性皮炎；系统性中毒的初起症状有腹疼或胃部疼痛、手脚不灵活、恶心、呕吐、腹泻，严重者可致白细胞及血小板减少，系统中毒的延缓症状有植物神经紊乱^[10]。King和Sullivan报道鬼臼毒素具有秋水仙碱样作用之后，引起人们的普遍注意，并导致一系列的医学、生物学和化学的研究，证明了鬼臼毒素的抗癌活性^[11]。

• 1. 哌啶甲酸的功效

哌啶甲酸是一种白色粉末状的化学物质。哌啶甲酸或其衍生物的处传统化学合成方法外还有酶解法等。哌啶甲酸或其衍生物可以广泛用作许多手性药物和生物活性物质的合成中间体^[12]，如抗癌药物雷帕霉素、局麻药物布比卡因以及抗抑郁药物哌苯甲醇等^[13]。3-哌啶甲酸含有刚性哌啶环的非蛋白β-氨基酸极性大易溶于水，显示了较好的神经递质GABA转运蛋白抑制活性，与2-哌啶甲酸、4-哌啶甲酸同为合成多种手性药物的重要中间体^[14]。

1.4.鬼臼毒素哌啶酸酯的合成意义

鬼臼毒素在治疗肿瘤类疾病时具有较大的医用价值，但由于自身具有毒性在治疗的同时也引发了一系列副作用。因此，合成一种比较高效和毒性低而且溶解性较好的鬼臼毒素衍生物成为了研究者们的研究目标。于是开始了以鬼臼毒素为先导化合物进行改造和修饰的实验从而制作出活性较高的衍生物。例如半合成鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷和替尼泊苷，对小细胞肺癌睾丸癌以及恶性淋巴肿瘤等多种癌症均有良好的疗效^[15]。这次实验最终目的是利用哌啶甲酸具有良好中间体的特性，与鬼臼毒素合成，从而得到既具有鬼臼毒素抗肿瘤性又能够减少副作用的鬼臼毒素哌啶酸酯。

实验部分

• 1. 实验材料

99%哌啶甲酸(C₆H₁₁NO₂)(批号：GA050150)；97%3-哌啶甲酸(C₆H₁₁NO₂)(批号：EE090063)；98%4-哌啶甲酸(C₆H₁₁NO₂)(批号：GI190106)；鬼臼毒素(C₂₂H₂₂O₈):高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)≥98%；N，N-二环乙基碳二亚胺（DCC）(C₁₃H₂₂N₂)；4-二甲基氨基吡啶（DMAP）(C₇H₁₀N₂)；99.5%甲醇(批号：20160307（分析纯AR）；99.5%二氯甲烷（批号：20160729）；柱层层析硅胶。

• 1. 实验仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；85-2控温磁力搅拌器；通风柜；SHZ-DIII循环水式真空泵；DL-4005低温冷却液循环泵；RE-3000旋转蒸发器；全自动雪花制冰机；电子天平；KQ-500B型超声波清洗机；DHG-9420B型电热恒温鼓风干燥箱；点样毛细管（0.3*100mm）；WFH-203三用紫外分析仪；硅胶板（50*100mm）；EPED-T60A型高纯水机；BS224S电子天平。

• 1. 实验方法
     1. 合成鬼臼毒素哌啶酸酯

a.使用电子天平称取0.2mmol约0.0829g鬼臼毒素和0.4mmol约0.0517g哌啶甲酸；将材料倒入10ml圆底烧瓶中并使用移液枪取约4ml无水二氯甲烷用于溶解底物；在圆底烧瓶中加入合适大小转子，使用全自动雪花制冰机制取适量冰块；将含有鬼臼毒素和哌啶甲酸的圆底烧瓶放入冰水混合物的烧杯中，使用蛇形冷凝管和85-2控温磁力搅拌器在0℃温度条件下进行搅拌约30分钟。

b.待反应到达30分钟后，去除小烧杯和冰水混合物；向反应液中加入N，N-二环乙基碳二亚胺（DCC、脱水剂）0.24mmol约0.0495g和DMAP0.24mmol约0.0293g；保持18℃条件下使用DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，反应约5小时得到反应液。

→

鬼臼毒素 哌啶甲酸 鬼臼毒素哌啶酸酯

图1 鬼臼毒素与哌啶甲酸合成鬼臼毒素哌啶酸酯

→

鬼臼毒素 3-哌啶甲酸 鬼臼毒素3-哌啶酸酯

图2 鬼臼毒素与3-哌啶甲酸合成鬼臼毒素3-哌啶酸酯

→

鬼臼毒素 4-哌啶甲酸 鬼臼毒素4-哌啶酸酯

图3 鬼臼毒素与4-哌啶甲酸合成鬼臼毒素4-哌啶酸酯

• • 1. 分离合成鬼臼毒素哌啶酸酯

a.由于不同物质在相同溶液中因为极性而导致溶解度不同，所以选择混合二氯甲烷-甲醇（100：6）、二氯甲烷-甲醇（100：3）、二氯甲烷-甲醇（100：1）不同比例的展开剂；然后用毛细管吸取适量反应液，点在硅胶板上，并在相同高度点样用二氯甲烷溶解的鬼臼毒素；经过对比当二氯甲烷与甲醇（100：1）时最为合适；将展开剂中极性较大的甲醇溶液减半，配比为二氯甲烷与甲醇（200：3）的比例作为流动相。

b.取200ml规格的玻璃层析柱，使用二氯甲烷进行润洗；取适量硅胶粉，加入适量二氯甲烷溶解并放入超声波清洗机中搅拌去除气泡；将硅胶匀速缓慢倒入玻璃层析柱中，高度为层析柱的1/2至1/3，等待硅胶柱凝实。

c.将反应液旋蒸浓缩，采用湿法加样法加入层析柱中；使用点样的方法检测是否有物质流出，一般每根试管收集约2ml过滤液；将收集到的过滤液进行旋蒸干燥收集产物。

• • 1. 薄层层析法检测产物

a.待测物的溶解取适量鬼臼毒素溶于二氯甲烷中充分溶解；取适量反应产物溶于二氯甲烷中充分溶解；

b.层析液的配置使用移液枪取3000μL二氯甲烷与90μL甲醇倒入磨口三角瓶中混合均匀，适量倒入广口瓶中；

c.使用毛细管吸取微量溶解的鬼臼毒素点在硅胶板左侧，吸取微量溶解的产物点在硅胶板右侧；使用镊子将硅胶板放置在含有层析液的广口瓶中；

d.将接近跑完的硅胶板用镊子取出，放置在WFH-203三用紫外分析仪上观察有无发生变化。

结果与分析

• 1. 目标产物的表征数据

a.鬼臼毒素哌啶酸酯：

外观：白色粉末状；

熔点：195℃；

产物为0.0874g；产率为64.93%，

¹HNMR(400MHz，CDCL₃)δ7.13（s，1H），6.49(s，1H)，6.38(s，2H)，5.96(dd，j=6.8，8.4Hz，2H)，4.75(d，j=7.2，1H)，4.57（t，j=12.8，2H），1.05(t，j=17.6，1H)，3.83(t，j=19.6，5H)，3.74(s，6H)3.20(d，j=5.6，1H)2.77-2.85(m，2H)，1.88(d，j=11.6，1H)，1.64(dd，j=13.6，3.6，2H)，1.30(t，j=30.8，3H)，1.11(q，j=33.6，1H)13CNMR(100MHz，CDCL3)174.65，157.05，153.05，147.29，139.28，137.17，135.58，133.41，131.07，130.02，115.34，109.08，105.82，101.26，77.06，72.62，71.47，69.85，68.90，60.81，56.23，49.24，45.38，44.06，42.66，40.68，34.37，25.12，

b.鬼臼毒素3-哌啶酸酯：

外观：白色固体

熔点：201℃

产物为0.0925g；收率为68.7%

¹HNMR(400MHz，CDCL₃)δ7.14(s，1H)，6.48(d，j=11.2Hz，1H)，6.38(s，1H)，5.94(dd，j=7.2，8.4Hz，2H)，4.74(d，j=8Hz，1H)，4.57(s，2H)，4.33(d，j=7.6Hz，1H)，4.05(t，j=17.6Hz，1H)，3.80(q，j=44.4Hz，10H)，3.43(d，j=7.6Hz，1H)，2.85-2.80(m，2H)，1.89(d，j=10.8Hz，1H)，1.64(dd，j=12.4，12.4Hz，2H)，1.30(t，j=29.2Hz，2H)，1010(q，j=33.2Hz，2H)；13CNMR(100MHz，CDCL3)174.69，157.08，153.52，152.55，147.35，146.97，138.22，135.61，133.48，131.04，130.51，129.52，115.37，109.68，108.67，106.44，105.47，101.25，77.07，72.04，69.34，60.82，56.22，53.45，49.22，45.39，42.32，25.22，

c.鬼臼毒素4-哌啶酸酯：

外观：白色固体

熔点：206℃

产物为0.0949g；产率为70.5%

¹HNMR(400MHz，CDCL₃)δ7.13(s，1H)，6.49(s，1H)，5.96(d，j=7.2，H)，4.74(d，j=8.8，1H)，4.56(t，j=13.2，3H)，4.33(d，j=7.6，1H)，4.04(t，j=17.6，2H)，3.85(s，1H)，3.81(d，j=4.8，4H)，3.74(s，6H)，2.85-2.76(m，2H)，1.89(d，j=12，1H)，1.68(d，j=13.6，2H)，1.33-1.25(m，3H)， 1.08(t，j=20.4，1H)13CNMR(100MHz，CDCL3)174.68，157.12，153.05，147.27，139.28，137.16，135.59，133.02，131.06，130.02，115.34，109.08，106.42，105.48，101.26，77.06，72.60，71.48，69.37，60.82，56.23，49.26，45.38，44.06，41.67，33.81，29.67，25.21，

• 1. 薄层层析法分析目标产物

薄层层析法主要适用于定性以及定量的物质分析。薄层色谱法所需仪器较简单，方法简便快速，可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和筛选 ^[16]。薄层层析的基本原理是，利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离^[17]。比较适合本实验检测次数多，需要快速检测的特点。

a.将溶解至二氯甲烷中的哌啶甲酸用毛细管点样在硅胶板上，使用层析液（二氯甲烷：甲醇=100：3）层析后，放置WFH-203三用紫外分析仪上发现无明显现象。

图4 哌啶甲酸 图5 3-哌啶甲酸 图6 4-哌啶甲酸

由图4、图5、图6可知哌啶甲酸以二氯甲烷为溶剂充分溶解后，使用薄层层析法检测目标产物无明显显色现象。

b.将溶解后的鬼臼毒素溶解后的目标产物分别使用毛细管点样在硅胶板左右两侧，进行层析后，放置WFH-203三用紫外分析仪上，见图。

图7 鬼臼毒素哌啶酸酯 图8 鬼臼毒素3-哌啶酸酯 图9 鬼臼毒素4-哌啶酸酯

展开剂为二氯甲烷-甲醇（100：3），图中s为鬼臼毒素、p1为鬼臼毒素哌啶酸酯、p2为鬼臼毒素3-哌啶酸酯、p3为鬼臼毒素4-哌啶酸酯。由图7、图8、图9可知鬼臼毒素与目标产物并不在同一高度，且经过检测哌啶甲酸使用薄层层析检测无现象，因此目标产物是一种新型的合成物，既不是鬼臼毒素同样不是哌啶甲酸。

• 1. 实验过程中出现的问题

a.在实验过程中对鬼臼毒素哌啶酸酯分离步骤时，出现蓝色液体，通过对N，N-二环乙基碳二亚胺（DCC）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP）溶解点样分析发现蓝色物质为4-二甲基氨基吡啶（DMAP）。

b.在实验过程中对鬼臼毒素哌啶酸酯分离步骤时，因得到的反应液是浑浊的悬浮液，向反应液中加入适量甲醇时悬浮物消失反应液变清澈，但加入甲醇导致层析时流动相中甲醇比例增大导致无法完全分离状况。

c.在实验过程中对鬼臼毒素哌啶酸酯分离步骤时，因得到的反应液是浑浊的悬浮液，在进行层析分离时反应液中的液体与悬浮物可能会因为没有同时溶解而导致无法分离状况；因此在进行层析分离前选择使用滤膜出去反应液中的悬浮物并进行旋转蒸发。

d.在实验过程中对鬼臼毒素哌啶酸酯分离步骤时，因选用转子体积较大，导致鬼臼毒素与哌啶甲酸无法充分反应，反应液中含有悬浮物影响最终产物产量；因此在下次实验室选用更小转子。

• 1. 展望

鬼臼毒素类似物在医药上的研究已经颇为深入，已明确鬼臼毒素类似物具有抗肿瘤活性^[18]。由于鬼臼毒素的巨大医用价值且直接会带来严重的副作用，因此研究者们都在不停的实验研究，致力于合成一种既保留鬼臼毒素抗肿瘤性又能够减少其对人体产生副作用的鬼臼类衍生物^[19]。随着科学技术的快速发展以及科研人员的无私奉献我相信将会有更多的更高效的鬼臼毒素衍生物被合成出来用于治疗癌症等疾病。

结论

本实验通过将哌啶甲酸与鬼臼毒素合成鬼臼毒素哌啶酸酯、鬼臼毒素3-哌啶酸酯、鬼臼毒素4-哌啶酸酯并通过薄层层析法对反应过程进行检测以及利用柱层析法对其分离纯化，通过氢谱图与碳谱图对合成的产物的结构进行表征，经结构表征时所合成的产物。实验产物鬼臼毒素哌啶酸酯产率为64.93%；鬼臼毒素3-哌啶酸酯产率为68.7%；鬼臼毒素4-哌啶酸酯产率为70.5%。

致谢

从最初刚刚接到论文的题目，到与老师同学共同为实验尝试创新，每一次的实验不论是成功还是失败都带给自己许多收获。从最初的不会识别使用实验器材琢磨不懂实验的流程原理到最后能够自己独立完成实验，这一次次的进步都是我继续前进的动力。

在这里我要感谢我的毕业论文指导老师，李登超老师。在论文题目刚刚确定时，老师便召集了我们，细心的为我们讲述实验的原因实验的集体流程以及实验的目的。在整个实验过程中，由于自己的实验技能不够成熟，犯了许多低级错误，而老师则是悉心的教导，耐心的讲述专业知识，从而使我不断地进步。在毕业论文初稿教给老师时，李登超老师耐心的看完整篇文章的内容框架，及时的向我提出了内容偏差格式出错等问题，从而帮助我更好的完成了毕业论文的创作。

附录

附图1 鬼臼毒素哌啶酸酯 氢谱图

附图2 鬼臼毒素3-哌啶酸酯 氢谱图

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