论文总字数：12549字

摘 要

植物生物节律是由生物钟调控的，生物钟又受到多个因子的调控。植物生物节律的精确调控，使植物能够对光周期开花时间、激素信号转导、生长、代谢以及逆境胁迫等多种生理活动进行协调。然而，植物生物钟的研究非常匮乏。本研究以模式植物拟南芥为研究对象，从xct-2突变体入手，利用荧光定量PCR手段证实xct-2基因参与调控拟南芥生物节律。利用半定量PCR手段检测发现，与野生型相比，xct2-2突变体中生物钟因子CCA1、PRR7和PRR9等成熟mRNA降低，证实xct-2基因通过调控生物钟因子进而调节生物节律。本研究对于理解生物节律的作用机制以及将生物节律的规律运用于农业性状的优化具有重要的科学意义。

关键词：生物节律，转录调控，生物钟，拟南芥

Abstract

Biological rhythm is regulated by circadian clock, which is controlled by multiple factors. The precise regulation of plant biorhythm enables plants to coordinate various physiological activities, such as photoperiod flowering time, hormone signal transduction, growth, metabolism and stress under stress. However, the mechanism underlying circadian clock control is limited. In this study, we identified the mutant xct-2 by PCR and confirmed that xct-2 gene was involved in the regulation of biological rhythm by qRT-PCR in Arabidopsis. Semi-quantitative PCR was performed to detect the expression level of circadian clock factors CCA1, PRR7 and PRR9 and found that the levels were decreased in xct-2 mutant compared with wild type. This study has important scientific significance for understanding the mechanism of biological rhythms and applying the rules of biological rhythms to the optimization of agricultural traits.

Key words: biological rhythm, transcriptional regulation, circadian clock, Arabidopsis thaliana

目录

1前言 1

1.1剪接复合体（剪接因子）的研究 1

1.1.1剪接复合体的定义 1

1.1.2可变街剪接的形式 1

1.1.3 两种剪接装置识别模型 2

1.1.4剪接复合体调节可变剪接过程 3

1.1.5剪接信号及识别 3

1.1.6 可变剪接的调控 4

1.2 节律研究 4

1.2.1生物节律的定义 4

1.2.2生物节律 5

1.2.3生物钟系统 5

1.3 XCT基因研究 6

2材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 植物实验材料 6

2.1.2 菌株和载体 6

2.1.3 酶以及各种分子生物学试剂 6

2.2 实验方法 6

2.2.1酵母双杂交 6

2.2.2 拟南芥的培养 7

2.2.3 实验样本收集 7

2.2.4 粗提植物总RNA 8

2.2.5 消化RNA中的DNA 8

2.2.6 反转录 8

2.2.7 实时荧光定量PCR 9

3结果与分析 10

3.1 xct-2突变体的鉴定 10

3.2 xct-2生物节律分析 10

3.2.1 植物总RNA提取分析 11

3.2.2 xct-2突变体生物节律表型分析 12

3.3 xct-2蛋白是剪接复合体组分 13

3.4 xct-2突变体生物节律分子机制结果 14

4 结论 16

致谢 18

1前言

1.1剪接复合体的研究

1.1.1剪接复合体的定义

可变剪接（Alternative splicing）是指转录产生的外显子（Exon）在RNA剪切过程中以多种方式重新连接的过程，在此过程所形成不同的mRNA可能会形成不同形式的蛋白。因此，一个基因可能会编码多种蛋白^[1]。

经研究表明，高等生物的基因比低等生物有更多的剪接方式，高等真核生物大于低等真核生物，脊椎动物大于非脊椎动物。但是，经过预测，人类基因组越有2400个基因可以编码蛋白质，简单的模式生物线虫约有19000个基因，而果蝇中约有14500个。基因组基因数量并不能完全反应物种间复杂性的差异^[2]。然而，可以确定的是可变剪接是产生蛋白质组多样性极为重要的机制之一。

最新研究表明，在拟南芥中，约有42%的基因会经历可变剪接，虽然可变剪接现象在植物基因中十分普遍，但在植物中一些剪接因子如何参与可变剪接调控的机制却鲜有报道。

1.1.2可变剪接的形式

可变剪接经研究,有大致以下几种剪接方式（图1-1）：1. 外显子跳读是指在成熟的 mRNA 中，外显子或保留或去除，形成的不同成熟形式的 mRNA；2. 可变的 3’位点选择是指不同大小的 mRNA 的产生取决于剪接识别的是近端还是远端的 3’SS；3. 可变5’位点选择，不同大小的 mRNA的产生取决于剪接识别的是近端还是远端的 5’SS； 4. 内含子保留，是指在成熟的 mRNA 中，内含子或保留或去除，形成不同成熟形式的mRNA；5. 互斥的外显子，是指在一个成熟转录本中相邻的两个外显子在剪接过程中只能有一个外显子被保留。其中，内含子保留是低等多细胞动物最普遍的剪切方式，在真菌和原生动物中广泛存在^[4]。从低等生物向高等生物演变的过程中，外显子跳读的剪切形式逐渐增加^[5-6]。

在拟南芥中，与在其他高等真核生物不同，其可变剪接形式中约56%为内含子保留，只有低于5%的为外显子跳读，提示可变剪接在植物进化过程中的作用较在动物中小，这有可能与植物可通过全基因组复制来增加其转录组及蛋白质组的多样性有关。

图 1-1 可变剪接的类型^[3]

1.1.3 两种剪接装置识别模型

可变剪接的基础是剪接装置特异性识别内含子和外显子，为了方便观察，建立了两种模型，一种是内含子的模型^[7]，指的是剪接调节子首先通过识别内含子上的子序列，而后再招募 U1 snRNP 和 U2AF 到 5’SS 及 3’SS 上，进而进行剪接。另一种是外显子模型^[8]，指的是剪接装置首先识别外显子上的剪接位点，在外显子上先进行剪接体的组装，然后进行剪接。

图 1-2 外显子和内含子识别模型

1.1.4剪接复合体调节可变剪接过程

剪接过程一般由剪接复合体来协调完成，剪接复合体由两部分组成，主要剪接复合体和次要剪接复合体^[9]。主要剪接复合体和次要剪接复合体所识别和作用的内含子类型不同，并且主要剪接复合体和次要剪接复合体只能识别其各自所对应的内含子再进行剪接，这也是他们的不同之处，互相负责不同的部分^[10]。

一般来说，剪接复合体符合以下三个部分：一丶RNA 或蛋白可以多次识别pre-mRNA 中的很多保守基序 二丶他们的互相作用通常较弱，但是可以通过叠加多个互相作用来加强，进而使得整体作用加强 三丶RNP在剪接的过程中会发生多次的重排。

图 1-3 剪接复合体剪接 pre-mRNA 过程

1.1.5剪接信号及识别

可变剪接的基础是剪接装置识别内含子和外显子，这种识别的调控具有组织部位及发育阶段的特异性。有两种模型阐明外显子和内含子的选择机制。一为内含子识别模型，是指剪接调节子首先通过识别内含子上剪接调节子序列，而后再招募 U1 snRNP 和 U2AF 到 5’SS 及 3’SS上，进而启动剪接的进行；二为外显子识别模型，是指基本的剪接装置首先识别外显子上的剪接位点，在外显子上进行剪接体的组装，进而启动剪接的进行。

1.1.6 可变剪接的调控

可变剪接过程中涉及到了多个复合物组成及构象的改变，这个过程受多个调控因子的调控。

1.2 节律研究

1.2.1生物节律的定义

生物节律是由生物钟产生的，这种节律可表现出多种方式，如在细胞水平的基因表达，在整体水平的活性变化等。区别于一般对环境信号的反应，生物钟调控下控下的生物钟节律须符合以下三条基本原则：（1）在无外界环境时间的提示的情况下，该节律也存在，并以 24h 为周期运行。生物节律周期的测定一般在恒定的温度、持续的光照或黑暗中进行，在这些条件下，有机体以其自由运行 （Free-running）的生物钟进行振荡，调控机体的节律性活动。（2）生物节律周 期的长度在一定的生理相关的温度范围内可以维持相对恒定，即温度补偿 （Temperature compensation）现象。早期人们认为，同化学反应过程一样，生物 钟也遵守生化反应的“Q10 法则”：即环境温度每增加 10℃，反应速率即可增加 1 倍（Q10 = 2）。但实际上，在生物体内，生物钟调控的生物节律的改变的约为 1，即人们发现机体有一定的温度耐受性，机体的这种耐受性确保了在环境 温度变化而节律长度^[11]

却保持相对稳定。（3）在合适的环境条件下生物钟可以被重新设定（Resetting）。自由运行的生物钟节律与环境的24小时节律的偏差使得內源的生物钟必须调整为与当地的时间一致，即外部的时间提示可以起到同步化机体內源的生物钟的作用。虽然一些动物的饮食行为也可以设定其生物钟，但一般 来说最明显的生物钟重新设定信号是光/暗循环和温度循环。

1.2.2生物节律

生物学意义上的时间是通过从毫秒到年的周期来测量的。昼夜节律，在 24 h 尺度上测量时间，是由一个最普遍存在和研究得最透彻的计时系统产生的。这种定时机制的核心是一种错综复杂的分子机制，在全身许多不同的组织中滴答滴答。然而，这些独立的节律是由大脑中的一个主时钟驯化的，它根据从外界接收到的光输入来协调组织特异性节律。

以睡眠觉醒周期为例，circadian 节律是内在时间系统的外在表现。基因、分子和生物化学方法的全部力量，再加上精确的行为观察，使我们对哺乳动物昼夜节律时间的认识得到了迅速的发展。这个系统的焦点是一个主时钟，位于前下丘脑的视交叉上核 (SCN)，它协调昼夜节律计划。理解昼夜节律时间的分子和生化基础的主要进展提供了一个快速进化的潜在时钟模型。最近的发展也彻底改变了我们对 SCN 输入和输出机制的看法。其中包括发现从视网膜到 SCN 的新视觉通路，将昼夜节律夹带（同步）到太阳日，以及阐明 SCN 时钟最终在生理和行为中产生输出节律的方式。定义哺乳动物昼夜节律的分子基础具有深远的意义。就基本的大脑机制而言，昼夜节律系统是最容易理解细胞和分子事件连接基因和行为的模型之一。

1.2.3 生物钟系统

生物钟的调控是由生物钟系统来完成的，非常的复杂而精确。生物钟系统可以分为三个模块^[12]，输入途径（Input pathway）、中心振荡器^[13]（Central oscillator）以及输出途径（Output pathway），这三个模块可以互相调控，形成生物钟调控的网络。

图 1-4 生物钟系统组成及简单的信号途径^[14]

1.3 XCT基因研究

许多不同的，广泛分类的分类群有一个内部生物钟，可以预测有节奏的变化环境。XAP5 CIRCADIAN TIMEKEEPER（XCT）调节生物钟和光形态发生。XCT对于正确的时钟功能至关重要：xct突变体在所有测试条件下缩短昼夜节律^[15]。但是，对于其如何参与调控生物节律的机制仍不清楚。

2材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物实验材料

实验所用到的拟南芥野生型为Columbia生态型，由本实验室长期保存。拟南芥xct-2突变体是由清华大学戚益军教授惠赠。

2.1.2 酶以及各种分子生物学试剂

实时荧光定量PCR所用的SYBR Premix Ex Taq为TaKaRa公司产品；MS盐、Phytagel为Sigma公司产品；其余常用的各种分子试剂均为国产或进口的分析纯试剂。

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥的培养

消毒种子：将收获后的拟南芥干种子加入1 ml超纯水浸泡至少30 min，之后在超净台中将水倒出，并加入1 ml酒精浸泡90 s，再用灭菌的超纯水洗涤3次，最后将种子浸泡于1 ml灭菌的超纯水中放在4C处理2-3天。

铺板：将种子播种到MS培养基上（1×MS盐、1%蔗糖、植物Agar，用KOH调节pH至5.8-5.9），置于植物培养箱中培养约一周左右。

移栽及生长：将幼苗移栽到蛭石：营养土为2:1的土中，置于16 h光照，8 h黑暗的培养室中生长。

2.2.2 实验样本收集

将点于MS培养基的拟南芥种子置于4C冰箱，第四天早上8点，准时将平皿置于12 h L/12 h D的光照培养箱中培养，22C生长7天。第8天早上8点，将12hL/12hD光周期改为持续光照，记为ZT0。从ZT24时开始取材，每四小时取一次材料，取至ZT68结束。

2.2.3 粗提植物总RNA

1）在样品中加入液氮并研磨成粉末放入离心管中。

2）将800 μl RNA plant reagent 和200 μl β-巯基乙醇混合后加入到样品所在的离心管中，充分振荡混匀，室温放置5 min。

3）加入300 μl氯仿，振荡混匀，4C 12000 rpm离心10 min。

4）取500 μl上层水相溶液转移到新新离心管中，加入等体积的异丙醇溶液，振荡混匀，室温放置10 min。

5）4C 12000 rpm离心10 min。

6）弃去上层水相溶液，加入1 ml 75%乙醇溶液，4C 5000 rpm离心3 min。

7）弃去上清溶液，下有白色沉淀，室温干燥直到沉淀变成完全透明即可。

8）加入50 μl DEPC-H2O溶解，50C金属浴促溶5 min，之后室温再静置10 min。

9）取1 μl RNA样品测浓度并进行琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量。

2.2.4 消化RNA中的DNA

1) 处理15 μg RNA样品，DNase和DNase buffer 均加入15 μl，最后DEPC-H₂O补齐到150 μl，混匀并振荡离心。

2）37C金属浴处理30 min。

3）加入DEPC-H2O补齐到400 μl。

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