马克斯克鲁维酵母以秸秆为原料产低聚木糖发酵条件优化及工艺设计
2023-09-13 08:53:14
论文总字数：16264字
摘 要
为了获得较高产量的低聚木糖，本实验对马克斯克鲁维酵母以秸秆为原料产低聚木糖进行了发酵条件优化。采用单因素法和正交试验法，对发酵培养基中碳源、氮源以及无机盐进行了优化，发酵液中的低聚木糖含量通过DNS法来测定，最终确定了马克斯克鲁维酵母以秸秆为原料产低聚木糖的最佳发酵培养基条件为玉米秸秆40g/L，酵母粉40g/L，KH2PO47g/L，MgSO40.3g/L。另外本文还对年产200吨低聚木糖进行了工艺设计，对发酵罐、种子罐等设备进行了设计。关键词：马克斯克鲁维酵母，秸秆，低聚木糖，条件优化，工艺设计
Abstract：In order to achieve a higher yield of xylose oligosaccharides,in this experiment, the fermentation conditions of Xylose oligosaccharide produced by Kluyveromyces marxianus from straw were optimized.Carbon source, nitrogen source and inorganic salt in fermentation medium were optimized by single factor method and orthogonal test method.Xylose oligosaccharide content in fermentation broth was determined by DNS method.Finally, it was determined that the optimum fermentation medium conditions for Kluyveromyces marxianus to produce xylose oligosaccharide with straw as raw material were corn straw 40g/L, yeast powder 40g/L, KH2PO47g/L and MgSO40.3g /L.In addition, the process design of 200 tons xylose oligosaccharide per year was carried out, and the fermentation tank, seed tank and other equipment were designed.
Keywords：Kluyveromyces marxianus,the straw,xylose oligosaccharide,conditions optimization,process design
目 录
1 前言 3
2 实验材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 菌种： 4
2.1.2平板种子培养基： 4
2.1.3 种子液培养基： 4
2.1.4 基本发酵培养基： 4
2.1.5 主要试剂： 4
2.1.6主要仪器和设备 4
2.2 实验方法 5
2.2.1 初始菌种活化的方法： 5
2.2.2 种子液配制的方法： 5
2.2.3 低聚木糖含量测定方法： 5
2.2.4 单因素法: 6
2.2.4.1 不同碳源种类对低聚木糖产量的影响 6
2.2.4.2 不同碳源浓度对低聚木糖产量的影响 6
2.2.4.3不同氮源种类对低聚木糖产量的影响 6
2.2.4.4不同氮源浓度对低聚木糖产量的影响 6
2.2.4.5不同无机盐浓度对低聚木糖产量的影响 6
2.2.5 正交试验法： 7
3 结果与分析 7
3.1木糖标准曲线 7
3.2 单因素实验结果与分析: 8
3.2.1 不同碳源种类对低聚木糖产量的影响 8
3.2.2 不同碳源浓度对低聚木糖产量的影响 9
3.2.3 不同氮源种类对低聚木糖产量的影响 9
3.2.4 不同氮源浓度对低聚木糖产量的影响 10
3.2.5 不同无机盐浓度对低聚木糖产量的影响 10
3.3 正交实验结果与分析: 11
4 工艺设计 12
4.1设计目的 12
4.2技术参数 12
4.3全厂物料衡算 13
4.3.1原料处理工段 13
4.3.1.1寡糖转化量 13
4.3.1.2木聚糖实际需求量 13
4.3.1.3玉米芯耗量 13
4.3.2 酶制取工段 13
4.4全厂化工设备计算、设计及选型 14
4.4.1原料处理工段设备的选型、设计及计算 14
4.4.1.1粉碎机的选型 14
4.4.1.2提取罐的设计 14
4.4.1.3滤液储罐的设计 15
4.4.2酶制取工段设备的选型、设计及计算 15
4.4.2.1发酵罐的设计 15
4.4.2.2种子罐的设计 18
4.4.3寡糖制备提取工段设备的选型、设计及计算 19
4.4.3.1糖化罐的设计 19
4.4.3.2脱色罐的设计 20
结 论 21
参考文献 22
致 谢 24
附录 25
1 前言
马克斯克鲁维酵母在"藏灵菇"中的各个菌相中，它属于一种很重要的菌相。到目前它已经在国内和国外，引起了很多研究者的关注。它具有耐高温、高生长速率、高生物量、食品安全性等特征[1]。高生长速率可以使得菌体的发酵时间减少。它广泛存在于发酵乳中，它可以发酵乳糖，对蛋白质进行降解，从而生成一些风味物质，如醇、酯、羧酸、乙酸异戊酯等[2] ；它也可以对半乳糖进行利用，在乳品的发酵过程中它可以单独用或者和乳酸菌一起用，从而得到的产品能被其赋予独特的风味和营养特性[3]。如果我们能够给马克思克鲁维酵母一个良好的培养，给它提供良好的发酵条件，那么它能够产生各种营养物质和那些对人体健康有益的活性物质，如铁、钙、维生素C、锌等[4]，这使它具有调节人体健康的作用。因此，近年来它吸引了世界各国营养学家和生物学家的普遍关注，大多数都对其代谢分泌营养物质和某些活性因子非常感兴趣和重视。
低聚木糖又被叫作木寡糖，近些年来它已经备受关注。它是由2~7个木糖分子通过β-1,4糖苷键结合形成的功能性聚合糖。在众多很好的甜味剂中它可以作为一种，低聚木糖的甜度和蔗糖的一半甜度相差不大，又由于动物的消化酶系统很难消化低聚木糖，并且其具有低卡路里，所以十分适用于那些喜欢甜品又怕发胖的人，同时这也有利于降低高血糖病人、肥胖病人和糖尿病病人的糖摄入量，又因为它有利于口腔健康，不引起龋齿，能促进钙等矿物质元素的吸收，所以他也是儿童、孕妇、老年人的食品中的一种理想的添加原料[5]。低聚木糖虽然对于人体来说难以消化和吸收，但是它是一种可发酵的糖，所以它是双歧杆菌的有效增殖的因素，能使双歧杆菌得到显著增殖[6]。双歧杆菌在代谢期间会产生乙酸和乳酸，这是有利的，能够加速肠道蠕动，轻泻，缓解便秘，经研究发现它能够减轻孕妇便秘的困扰，并且没有不利的影响[7]。有许多方法用作制备低聚木糖，比如热水抽提法、微波法、酶解法和酸水解法等[8]。其中酶解法是目前用于制备木寡糖的主要方法。酶解法反应条件温和，不需要高温高压，对设备的要求也不高。我国农业废弃物有很多，如小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆等，是一个农业大国。这些农业废弃物很多都没有得到充分的资源化利用，它们通常被农民们焚烧或者被用作饲料等，被利用的价值很低，同时还对环境造成了污染，所以农业废弃物的利用价值还有待开发。这些农业生产的副产品中半纤维素的含量及其丰富，而半纤维素的存在方式主要以阿拉伯木聚糖这一方式存在，在借助一些外力的情况下可以分解成低聚木糖。本实验中碳源种类对低聚木糖产量的影响的研究，选用小麦秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆这三种秸秆来进行探讨研究，既实现了农副产品的深加工，提高了农业副产品的利用价值，还避免了这些农业废弃物被焚烧，保护了环境，有利于农业产业化结构的调整，为农村增收创收工作提供了保障。
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种：
淮阴师范学院实验室保藏的马克斯克鲁维酵母
2.1.2平板种子培养基：
YPD培养基：酵母粉1.5g、蛋白胨3g、葡萄糖3g、琼脂粉3g、蒸馏水150ml。锥形瓶包扎好后放到灭菌锅中，121℃灭菌30min[9]。
为了避免培养基凝固，在其稍微冷却后，立刻在无菌操作台上倒制平板[10]。
2.1.3 种子液培养基：
YPD培养基：酵母粉1.5g、蛋白胨3g、葡萄糖3g、蒸馏水150ml。锥形瓶包扎好后放到灭菌锅中，121℃灭菌30min。
2.1.4 基本发酵培养基：
YPD培养基：酵母粉10 g /L、蛋白胨20 g /L、葡萄糖20 g /L。自然ph[11]，锥形瓶包扎好后放到灭菌锅中，121℃灭菌30min。
2.1.5 主要试剂：
表 1试剂表
DNS试剂 | 量取 750 mL 去离子水，加热至微热后顺序加入10.00 g 3,5-二硝基水杨酸、16.00 g NaOH、5.00 g 苯酚、5.00 g 亚硫酸钠和 300.00 g 酒石酸钾钠，溶解后定容至 1000 mL， |
1mg/ml木糖标准溶液 | 先用天平称取100mg的无水木糖(105℃干燥至恒重），然后用蒸馏水定容至100ml |
发酵培养基中的化学制品 | 水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、葡萄糖、尿素、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾 |
注：DNS试剂[12]配于棕色瓶中室温下暗处放置一周后使用。
2.1.6主要仪器和设备
表 2仪器和设备表
GNP-9080型隔水式恒温培养箱 | HYG-C型多功能摇床 |
SHANGPING FA2004B电子天平 | SHANGPING YP1201N电子天平 |
LS-75HJ型高压灭菌锅 | UV759分光光度计 |
SW-CJ-2D型净化工作台 | 海尔MM-2270EG微波炉 |
2.2 实验方法
2.2.1 初始菌种活化的方法：
将马克斯克鲁维酵母从冰箱中取出，在经过紫外线灭过菌后的超净台上进行平板划线。将接种后的平板培养基放到30℃恒温培养箱中培养5天，得到活化后的马克斯克鲁维酵母，用作下一步的种子液的配制。
2.2.2 种子液配制的方法：
平板上活化好的马克斯克鲁维酵母刮取到YPD培养基中，将其摇匀，然后将其放到30℃，150r/min的摇床中，培养3天。
2.2.3 低聚木糖含量测定方法：
标准曲线绘制[13]和发酵液低聚木糖含量测定（DNS法[14]）：
标准曲线绘制 | |||||||
试管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
木糖标准溶液ml | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 |
蒸馏水ml | 2 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 0.8 |
加2mlDNS试剂，沸水浴5min，冷水冷却至室温定容至25ml，测OD540值 | |||||||
发酵液低聚木糖含量测定 | |||||||
取发酵液1ml于离心管中，在 4500r/min下离心5min。取上清液稀释适当倍数，配制成样品，保证其吸光值位于0~1之间，取2ml稀释后样品，再加2mlDNS试剂，沸水浴5min，冷水冷却至室温定容至25ml，测OD540值。最后根据标准曲线获得低聚木糖含量。 | |||||||
表 3标曲绘制与发酵液含糖量测定
2.2.4 单因素法:
对发酵培养基的某一特定成分进行单独改变，其他条件不变，从而对培养基中碳源种类、碳源浓度、氮源种类、氮源浓度、KH2PO4浓度、MgSO4浓度进行探究，得出最优的碳源及其浓度、氮源及其浓度、KH2PO4浓度和MgSO4浓度。
2.2.4.1 不同碳源种类对低聚木糖产量的影响
分别加入水稻秸秆20g/L、小麦秸秆20g/L、玉米秸秆20g/L，发酵培养基的其他成分保持不变。配制好后，将锥形瓶包扎好，放到灭菌锅中，121℃高温下灭菌30min。灭完后到经过紫外线灭过菌的超净台上用移液枪吸取种子液到发酵培养基中。将接完种的发酵培养基放到30℃，150r/min的摇床中培养3天。通过测定发酵液含糖量确定最优碳源种类。
2.2.4.2 不同碳源浓度对低聚木糖产量的影响
分别加入10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L上一步确定好的碳源，发酵培养基的其他成分保持不变。配制完进行灭菌，在超净台接种后，放到30℃，150r/min的摇床中培养3天。通过测定低聚木糖产量来确定最优碳源浓度。
2.2.4.3不同氮源种类对低聚木糖产量的影响
基本发酵培养基的其他成分保持不变，用上一步确定好的碳源及其浓度，分别加入（NH4）2SO4 20g/L、酵母膏 20g/L 、蛋白胨20g/L、尿素 20g/L。配制完进行灭菌，在超净台接种后，放到30℃，150r/min的摇床中培养3天后测含糖量，最优氮源种类由此得出。
2.2.4.4不同氮源浓度对低聚木糖产量的影响
用上一步确定好的碳源及其浓度，发酵培养基的其他成分保持不变，分别加入10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L上一步确定好的氮源。配制完进行灭菌，在超净台接种后，放到30℃，150r/min的摇床中培养3天。通过测定低聚木糖产量来确定最优氮源浓度。
2.2.4.5不同无机盐浓度对低聚木糖产量的影响
马克斯克鲁维酵母的生物量可通过分别添加一定浓度的硫酸镁和磷酸二氢钾在一定范围下提高，所以下面研究不同硫酸镁和磷酸二氢钾浓度对马克斯克鲁维酵母以秸秆为原料产低聚木糖含量的影响。
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