论文总字数：10380字

摘 要

本文采用了分光光度法，对山药豆中多酚氧化酶（PPO）的活性进行了测定，以及对PPO的性质进行了初步研究。通过测定不同反应温度、pH、底物浓度、酶浓度的PPO活性，探究这些特性对PPO活力的影响，并在此基础上，研究抑制剂如抗坏血酸、柠檬酸NaCl对PPO褐变的抑制效果。实验结果表明：当山药豆多酚氧化酶的反应温度为30℃、pH为5.0、邻苯二酚底物浓度为0.04mol/L时，多酚氧化酶的活性最高。在山药豆PPO活性的测定实验中，以柠檬酸、NaCl、抗坏血酸作为抑制剂，其抑制作用强度依次为：NaCllt;柠檬酸lt;抗坏血酸，在添加量较少的情况下，抗坏血酸浓度为3mmol/L时其抑制效果最好。

关 键 词：山药豆，多酚氧化酶，活性，抑制剂

Abstract：This article made a research on the activities of Polyphenol Oxidase (PPO) of Huaian dioscorea opposita by spectrophotometry and did a preliminary study on the features of PPO. By measuring the different reaction activities of temperature, pH, substrate concentration, enzyme concentration of PPO, studying the impact of these characteristics on PPO activities, and on this basis, inhibitors such as ascorbic acid, citric acid were studied to control browning during the extraction of anthocyanins. The results of experiment showed that the activities of Polyphenol Oxidase (PPO) of dioscorea opposita of the optimal temperature and pH is 30℃and 5.0, and when the concentration of catechol were 0.04mol/L, activity of Polyphenol Oxidase (PPO) reached its highest. In the experiments with ascorbic acid, citric acid and sodium chloride as inhibitors, the effect of inhibition was in turn, ascorbic acidgt; citric acidgt; sodium chloride. In the case of less additions of inhibitor, the best effect of inhibition was the ascorbic acid concentration was 3mmol/L.

Keywords：Dioscorea opposita, Polyphenol oxidase, activity, inhibitors

目 录

1 前言 3

2 材料与方法 3

2.1 实验材料 3

2.2 实验仪器 3

2.3 实验方法 4

3 多酚氧化酶（PPO）的性质研究 4

3.1 温度对PPO活力的影响 4

3.2 pH值对PPO活力的影响 4

3.3 酶液浓度对PPO活力的影响 5

3.4 底物浓度对PPO活力的影响 5

3.5 不同抑制剂对PPO活力的影响 5

4 结果与讨论 6

4.1 山药豆PPO反应产物的可见吸收光谱 6

4.2 山药豆PPO最适温度的确定 6

4.3 山药豆PPO最适pH值的确定 7

4.4 山药豆PPO最适酶液浓度的确定 7

4.4 山药豆PPO最适底物浓度的确定 8

4.6 抑制剂对山药豆PPO活力的影响 9

结论 11

参考文献 12

致谢 13

1 前言

山药豆又称“零余子”，是一种薯蓣科植物，能够很好地帮助消化、滋补身体、止泻^[1]，富含多种营养物质，是极具价值的保健食品^[2]。若将山药豆和灵芝混合起来服用，可以起到预防和治疗糖尿病的功效。多酚氧化酶是一种含铜的氧化还原酶，多酚氧化酶通过与多酚类物质接触，可催化多酚类物质氧化成为邻醌，其广泛存在于甘薯、马铃薯、苹果、香蕉、等植物中。在一系列加工和贮藏的过程中，山药豆很容易发生褐变,导致其色泽和质地的改变，从而降低了山药豆的营养价值。酶促褐变现象^[3]是果蔬加工过程中普遍存在的一种现象,经常发生在水果和蔬菜果肉里颜色较浅的部位，当蔬果被置于恶劣的环境或者其果肉受到严重地机械损害，如在多酚氧化酶(PPO)的催化作用下，果蔬内的多酚类物质开始反应而呈现出褐变特征，其中与褐变程度有着密切关系的是果蔬中的酚类物质含量和PPO活性^[4]。酶促反应^[5]是多酚氧化酶间接相互作用的结果,生存在于适宜细胞部位的山药豆多酚氧化酶,一旦山药豆PPO被损害,多酚氧化酶就会从山药豆组织中脱离出来，与空气中的氧气结合，导致多酚氧化酶类物质转变为邻醌，接着邻醌相互聚集通过各种作用合成高分子聚合物，从而促进了黑色素的生成，就是所谓的褐变现象^[6]。自曾多酚氧化酶从不同的植物中分离出来，多酚氧化酶提取的最大障碍是植物中富含的多酚类物质是酶的天然变性剂和沉淀剂，当细胞破碎时，酶与多酚类物质接触，形成不可逆的沉淀，从而使酶丧失活力^[7]。国内外对植物组织褐变的研究结果表明，组织的褐变现象主要是由于多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质所致^[8]。本文通过以邻苯二酚与多酚氧化酶（PPO）反应显色测定山药豆多酚氧化酶的活性，以及研究几种抑制剂对山药豆中多酚氧化酶活性的影响。

2 材料与方法

2.1 实验材料

山药豆，个体大小均匀，新鲜无损害，储藏于4^oC冰箱中；配置的0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸二氢钾和磷酸氢二钾）；抗坏血酸、柠檬酸、邻苯二酚、氯化钠均为分析纯。

2.2 实验仪器

表1 实验仪器

仪器名称	产地
TGL-16型 高速冷冻离心机	北京长流科学仪器公司
YP1201N型 电子天平	上海精密科学仪器有限公司
PHS-3C型 pH计	上海仪电科学仪器股份有限公司
WH-3型 微型旋涡混合仪	上海沪西分析仪器厂有限公司
HH-S型 恒温水浴锅	金坛市亿通电子有限公司
722S型 可见分光光度计	上海精密科学仪器有限公司
DS1型 高速组织搅拌机	上海标模科学仪器有限公司

2.3 实验方法

2.3.1 多酚氧化酶（PPO）的提取

对李新华^[9]的提取方法进行优化，首先将购买来的山药豆在冰浴中洗净、去皮，称取30g，将其切碎研磨成各个小块，加入100mL 0.05mol/L预冷的4^oC磷酸缓冲液（pH7.0）于高速组织匀浆机中研碎、打浆，然后将匀浆后的山药豆组织液装入离心管中，接着放入4^oC冷冻离心机中离心（将转速和时间分别设置为15000r/min、30分钟），最后用移液枪将离心管的上层清液转移至三角瓶中，得到的液体就是多酚氧化酶粗酶液，冷藏于4℃冰箱中等待下次使用。

2.3.2 多酚氧化酶（PPO）最适波长的选择

取两支洁净的空试管，各加入2mL预冷的4^oC磷酸buffer（pH7.0）和1mL 1%邻苯二酚，用移液枪向一支试管加入0.2mL的酶液，另一支试管中加入0.2mL蒸馏水作为空白对照管，加完试剂后在旋涡混合仪中混合数秒使其充分混匀，再立即将反应体系放入30℃水浴锅中加热10min，反应完成后，迅速用分光光度计测定酶活，检测在340～500nm波长范围内山药豆PPO的紫外可见吸光值，可重复几次，找出最适测量波长。（使用分光光度计前要预热30分钟）。

2.3.3 多酚氧化酶（PPO）活力的测定

利用分光光度法，首先吸取2mL 0.05mol/L预冷的磷酸buffer（pH7.0）于两支试管中，再分别加入1mL质量浓度为1%的邻苯二酚溶液作为底物，接着在一支试管中加入0.2mL粗酶液，另一支试管中加入0.2mL蒸馏水作为空白溶液，混匀后放入30℃恒温水浴锅中加热10min，反应完成后立即测定412nm处的粗酶液吸光值，每隔1分钟读取一次OD值，共记录10分钟。此波长下的吸光值以表示山药豆的PPO活性。

酶活力单位定义为：在测定条件下，每毫升酶液以每分钟OD值改变0.001为1个酶活力单位（U）^[10]。

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