乌苏里拟鲿MSTN基因的克隆与分析
2023-11-09 09:08:22
论文总字数：17649字
摘 要
乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）是具有一定经济价值的鲿科鱼类。它以其良好的食用价值和高的营养价值而备受青睐。本研究通过克隆和测序，得到乌苏里拟鲿MSTN基因的全长。结果表明，乌苏里拟鲿的MSTN基因的长度为1327bp氨基酸编码区长度为1182bp。对其编码蛋白的空间结构进行了预测。对乌苏里拟鲿的核苷酸序列和氨基酸序列与其他物种的序列进行对比分析发现乌苏里拟鲿在核苷酸序列和氨基酸序列与鲿科鱼类相似度较高，亲缘关系较近，相似度较低的是其他鱼类和哺乳动物，亲缘关系远。本研究获得的MSTN相关信息将为乌苏里拟鲿该基因的功能研究，以及今后分子标记辅助育种提供可能。关键词：乌苏里拟鲿 ，MSTN基因，基因克隆，序列对比分析
Abstract: Pseudobagrus ussuriensis is a Bagrid fish with potential economic values. Myostatin (MSTN) is a member of TGF-β super-family and negatively regulates muscle growth and development. Because of its function in of muscle growth control,MSTN gene has potential application values in the field of aquatic breeding. In this study, the full-length MSTN gene of Pseudobagrus ussuriensis was obtained by cloning and sequencing. The MSTN gene of Pseudobagrus ussuriensis was 1327 bp in length and coding region was 1182 bp . Nucleotide and amino acid sequences of Pseudobagrus ussuriensis were compared with that nucleotide of other species and the results indicated that the nucleotide and amino acid sequences of Pseudobagrus ussuriensis were high in similarity with other Bagrid fishes, indicating their close relationships, while the relationships with other fish and mammals were far. The information of MSTN obtained in this study will provide a possibility for the functional study of this gene in Pseudobagrus ussuriensis and will be helpful for future studies on molecular marker-assisted selection breeding of this species.
Key words: Pseudobagrus ussuriensis, MSTN gene, Gene cloning, Sequence contrast analysis
1前言
1.1 MSTN基因研究概况
肌肉生长抑制素基因(Myostatin MSTN) 属于转化生长因子TGF-β家族[1]。研究发现该基因的缺失、插入或突变会引起肌细胞增殖，从而提高产肉力，表现出双肌的特征[2]。
MSTN是一种分泌型多肽。对这些鱼类MSTN基因的研究中可以看出，鱼类 MSTN均是由3个外显子和2个内含子组成[8]。1997年美国John Hopkins大学医学院的McPherron等在研究转化生长因子TGF-β时[5],在小鼠的骨骼肌细胞中发现并首次扩增出该基因的cDNA[6]。研究表明[7]该基因在动物肌肉生长中起重要的抑制作用。
MSTN早期研究主要是在对哺乳动物的作用上，发现MSTN对肌肉生长拥有调节等功能。在对鱼类MSTN的研究中也发现其拥有近似的功效。它拥有可通过抑制IGF-Ⅰ/PI3K/Akt骨骼肌增殖通路致使肌肉萎缩。为了提高肌肉萎缩基因的表达可以通过抑制Akt的磷酸化[8]。
MSTN的作用机理：通过抑制多种哺乳动物细胞的细胞周期进程使细胞周期停留在G1期。抑制成肌细胞的生长可以通过阻断细胞周期的G1和G2/M 期来实现[9]。G1和S期的进程受多级周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶（Cdks）共同调控[11]。利用MSTN处理成肌细胞发现，p21的表达量明显上升，Cdk2的表达量在下降[12]。据推测，MSTN通过Rb蛋白去磷酸化来抑制G1期成肌细胞的生长并通过p21抑制使cyclin-E和Cdk2的失活[13]。
1.2乌苏里拟鲿概述
乌苏里拟鲿 (Pseudobagrus ussuriensis) 隶属于鲶形目,鲿科，拟鲿属，广泛分布于黑龙江等水域。该鱼体表无鳞、无肌间剌、肉味鲜美、具有多种保健功能。早在明清时就有该鱼的文字记载，是我国特色的名贵淡水鱼类品种[14]。在上世纪中叶，野生的乌苏里拟鲿仍旧很常见。 新世纪以来，由于捕捞日益增多[17]等因素的影响，致使目前在很多水域已很难捕获野生个体,导使市场需求旺盛，价格较优，前景十分看好[12]。目前有关乌苏里拟鲿的研究主要集中在分类[18]、形态[19]、生物学[20]、驯养[21]等方面，且取得初步进展，这为乌苏里拟鲿作为经济鱼类的开发、养殖、资源增殖等奠定了基础[22]。但是目前关于乌苏里拟鲿的生长培育还未见报道，因此乌苏里拟鲿的肌肉生长相关有待研究[23]。
1.3研究目的与意义
MSTN基因的克隆与分析的相关研究现在在牲畜中报导较多。MSTN基因自其被发现以来一直备受科研工作者的关注[24]。目前多种鱼类中已开展MSTN基因的相关研究，已克隆得到多种鱼类的MSTN基因[25], 而乌苏里拟鲿少见报导。本研究拟通过基因克隆和序列多态分析，获得乌苏里拟鲿基因结构及其与其他物种的氨基酸序列关系，为以后乌苏里拟鲿生长性状的关联性分析奠定基础，预测了其编码蛋白的空间结构，从而为乌苏里拟鲿的分子标记辅助提供潜在可能。研究乌苏里拟鲿MSTN基因以此来获得质量更佳的乌苏里拟鲿，满足市场需求，促进经济发展。
2 材料与操作步骤
2.1 实验材料
2.1.1 实验所用仪器
VORTEX-5震荡器
Mini-7k 微型离心机
Gel DocTM EZ Imager凝胶成像系统
DYY-6C型电泳仪电源
UVG20 紫外分析仪
Eppendorf单道微量可调移液枪
ND-2000C微量紫外分光光度计
DK-S24电热恒温水浴锅
SN210C灭菌锅
HPS-160 生化培养箱
PCR热循环仪
DH6-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱
IMS-100 全自动雪花制冰机
TGL-16GB 高速台式离心机
BSA124S 电子天平
2.1.2实验所用其他材料、试剂
乌苏里拟鲿 取自实验室人工养殖
质粒 Takara公司
DH5 α感受态细胞
AGAROSE G-10 琼脂糖
LB AMP 有氨苄青霉素LB液体培养基
LB AMP- 无氨苄青霉素LB液体培养基
HiFi-Script cDNA 第一链合成试剂盒
Gel Extraction Ki琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
2.2 引物设计
根据NCBI Genbank中其他物种的MSTN的cDNA利用Primer Premier 5.0软件设计克隆乌苏里拟鲿MSTN基因的核心片段简并引物：
表1乌苏里拟鲿MSTN基因引物信息
引物名称 | 序列（5’-3’） | 产物长度（bp） | 退火温度 （℃） |
Ssmstn-1F | GACCTACTCAAGSAGTTWGAYC | 674 | 54 |
Ssmstn-1R | GATTCTTGTAGGAGTGGTAGC |
生工生物工程（上海）有限公司合成。
2.3 乌苏里拟鲿肌肉组织总RNA提取
乌苏里拟鲿肌肉组织RNA提取全过程需戴乳胶手套，除离心外的所有操作都需要在酒精灯火焰旁进行，操作过程中尽量少说话（最后配戴口罩），以免样品污染。
1）取一盒冰，一个培养皿，灭菌过的剪刀和镊子，将组织取出后立刻置于冰上，避免RNA降解。
2）取一条乌苏里拟鲿，剪断脊髓，切取50mg左右肌肉组织，迅速地加入到装有500 μL TRIzol Reagent提取液的2 mL的EP管中，用匀浆器在冰上将样品彻底匀浆。
3）匀浆后的样品在室温下静置5 min，以完全分裂核蛋白复合体。
4）加入0.1 mL氯仿剧烈摇动15 s，使充分混合后室温放置2-5 min。
5）12,000 r/min转速于4 ℃离心15 min，离心后分三层，取上清液。
6）转移上清，加入0.25 mL异丙醇，混匀静置10 min。
7）12, 000 r/min转速于4 ℃离心10 min，在EP管中呈现少许胶状沉淀。
8）倒掉上清，加入0.5 mL 75％乙醇缓慢洗涤，能见到少许白色片状沉淀。
9）9000 r/min转速于4 ℃离心5 min，缓慢地倾去废液，在超净台上进行干燥5-10 min，向其中加入无RNA酶水100 μL溶解2-3小时。
10）用无RNA酶枪头汲取1 μL RNA在D2000分光光度仪上测定其浓度以检测RNA质量。RNA质量亦可用电泳法检测：用1 μL RNA在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，要是呈现显著的两条带，且第一条带是第二条带亮度的两倍的样品认为是高质量的RNA。
11）检测合格的RNA可用于cDNA的合成。
2.4 核心片段扩增
2.4.1 cDNA第一链合成
1）合成体系
以提取的RNA为模板，按照下列体系进行逆转录体系配制：
试剂 | 20 μL反应体系 |
dNTP Mix，2.5mM Each | 4 μL |
Primer Mix | 2 μL |
RNA Template | 1 μL |
5×RT Buffer | 4 μL |
SuperRT: 200U/μL | 1 μL |
DTT: 0.1M | 2 μL |
RNase-Free water | 6μL |
涡旋震荡混匀，短暂离心。用PCR仪孵育后，短暂离心后冷却，可用于PCR反应。
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