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摘 要

玫瑰孢链霉菌的代谢产物—达托霉素是目前使用率最高的一种的抗生素。病原菌对抗生素产生抗药性是全球医药界面临的严峻的挑战，而寻找能有效抑制抗药菌的抗生素是解决这一问题的根本途径。本实验首先对出发菌株生态学特性进行考察，再利用紫外诱变及效价测定法测定致死率和筛选达托霉素高产菌株，并通过与标准品达托霉素效价的标准曲线对比，测出高产菌株的产量，通过多次效价测定确定其稳定性。本实验最后筛选得到高产菌株DZ-0，其效价达到300mg/l，较原始菌株提高50%。

关键词：达托霉素，玫瑰孢链霉菌，紫外诱变，抑菌圈

Abstract：The Secondary metabolites of Streptomyces roseosporus - Daptomycin is one of the highest rates of antibiotic present. Bacteria resistant to antibiotics are serious challenges facing the global pharmaceutical industry, and to find effective suppression of antibiotic resistant bacteria is the fundamental way to solve this problem. In this study, the first ecological characteristics of the original strain inspect, re-use UV and potency assay daptomycin mortality and screening high-yield strains, and with the standard daptomycin potency standard curve comparison, High Yield measured strains were measured to determine its stability through multiple potency. In this study, high-yield strains screened last DZ-0, the titer reached 300mg / l, 50% higher than the original strain.

Keyword: Daptomycin，Streptomyces roseosporus，Ultraviolet mutagenesis，Inhibition zone

目录

1 前言 3

1.1 A21978C及达托霉素 3

1.1.1 A21978C及达托霉素简介 3

1.1.2 A21978C的抗菌活性和耐药性 4

1.1.3 达托霉素的临床应用 4

1.2 A21978C的诱变育种及高产菌株筛选 5

1.3效价测定及稳定性研究 5

1.4本课题主要研究内容、意义及实验流程图 5

1.4.1本课题主要研究内容 5

1.4.2本课题研究意义 5

1.4.3 实验流程图 6

2材料与方法 7

2.1实验器材与试剂 7

2.1.1实验仪器 7

2.1.2实验试剂 7

2.2实验所用菌种 7

2.3实验所用培养基 7

2.4实验方法 8

2.4.1菌种保藏方法 8

2.4.2 菌株扩大培养及活化 8

2.4.3 菌悬液的制备及浓度梯度的选择 9

2.4.4 紫外诱变 9

2.4.5 高产菌株的筛选及保藏 9

2.4.6 效价测定 10

2.4.7 高产菌株稳定性考察 11

3 结果与讨论 12

3.1原始菌株生长状况 12

3.2 致死率及高产菌株筛选 12

3.3高产菌株稳定性考察 14

4 结论与展望 15

4.1 结论 15

4.2展望 15

参 考 文 献 16

致谢 18

1 前言

1.1 A21978C及达托霉素

1.1.1 A21978C及达托霉素简介

A21978C是玫瑰链霉菌的新抗生素的发酵提取物，具有新型化学结构和行为模式。达托霉素对几乎所有细菌（包括耐药细菌），如耐万古霉素肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、糖肽类敏感金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和青霉素耐药肺炎链球菌有明显的抑制性明显。玫瑰孢链霉菌的发酵产物A21978C0 4主链的组成部分C0~C3中，C0为达托霉素 ^[2]。虽然A21978C4个组分非常相似，但它们的抗菌活性和细胞毒性相当大的差异，其抗菌活性随碳链增加其细胞毒性也将增加，这对应于达托霉素（A21978C0）最大治疗效果^[3~4]。

图1-1 A21978C组分（C0：R=正癸酰基，C1：R=反异-十一烷酰基，

C2：R=异十二烷酰基，C3：R=反异-十三烷酰基）

A21978C组分C0~C1中C0为达托霉素，达托霉素的分子式为C⁷²H¹⁰¹N¹⁷O²⁶，分子量为1621。其化学结构式见图1-1和1-2。达托霉素是玫瑰孢链霉菌的次级代谢产物。礼来公司1961年从土耳其阿拉拉特山土样中分离筛选得到玫瑰孢链霉菌，并从其发酵产物中提取得到达托霉素^[5]。礼来公司在1980年开发出达托霉素注射剂，临床上用于耐药金葡菌引起的感染。2003年经美国FDA批准上市，用于治疗皮肤感染与皮肤软组织感染，由于其特有的抗菌机制和化学结构，其在临床上有抗菌谱广，药效高，副作用小等优点^[6]。

图1-2达托霉素的结构图

1.1.2 A21978C的抗菌活性和耐药性

虽然我们仍然不明确达托霉素的确切机制，但可以肯定的是它的抗菌活性和耐其他抗生素的阶段而言大大提高。达托霉素不能渗透进入细胞质也不会渗透到细胞质中，它会破坏细菌，并通过多个膜发挥杀菌的功能作用。膜结合蛋白的达托霉素的作用包括抑制糖肽的合成，抑制壁酸和磷脂膜电位耗散效应的合成。在达托霉素的临床试验体外抗菌活性显示出大多数革兰阳性菌有较强的抑制作用。达托霉素的发病率是非常罕见的。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小于10^-10，小于10^-8的概率是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌，而粪肠球菌小于10^{-9 [ 13 ]}。

1.1.3 达托霉素的临床应用

达托霉素早期的研究人员在20世纪80年代发现并随后做了静脉注射用于革兰氏阳性菌感染的治疗。 20世纪80年代和90年代初，进行了19例Ⅰ和Ⅱ期临床试验，其中超过370人参加，结果发现达托霉素对皮肤和软组织感染和菌血症的结果是令人鼓舞的。适当的剂量能有效改善感染性心内膜炎。 1997年，立体派的达托霉素的专利来自美国礼来公司，并分别在菌血症和复杂性皮肤和软组织感染中研究成果显著。达托霉素和传统疗法对皮肤和软组织感染有相媲美的效果。在可评价的患者中，达托霉素在临床反应和细菌学疗效与良好的相关性传统疗法。无论是在细菌学的“治愈”率分别为96.1%和93.9%。临床试验表明达托霉素是大多数革兰氏阳性菌有明显的抑制效果。

1.2 A21978C的诱变育种及高产菌株筛选

紫外诱变培育达托霉素高产菌株是最直接、最有效的获得高产菌株的途径 ^[8]。对于紫外照射诱变的原理有很多报道，但是比较公认的原理是紫外照射使DNA中的嘧啶形成了二聚体，共价键在嘧啶间形成，双键之间的氢键作用力减弱，导致形成的双链结构扭曲，正常碱基间的配对受到阻碍，另外双链也会因为二聚体的形成而无法解开，DNA无法正常复制和转录，最终引起突变。具体菌株的最适紫外剂量需通过实验确定。今年来研究发现，诱变的正突变率与致死率之间存在一定的关联性，一般采用致死率为70%~80%的诱变剂量，因此可通过致死率结果来选择诱变剂量。

1.3效价测定及稳定性研究

本实验采用的达托霉素标准品产量为150mg/l ，实验采用测定效价法所得数据与标准品对比得出高产菌株产量，并进行多次传代培养，考察产量是否稳定。

1.4本课题主要研究内容、意义及实验流程图

1.4.1本课题主要研究内容

针对目前研究现状，特别是国内产量偏低的事实，我们将从以下几个方面入手：

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