论文总字数：17929字

摘 要

目的：通过定点突变，在重组弹性蛋白酶氨基酸序列中引入三个N-糖基化位点，分析N-糖基化对该弹性蛋白酶热稳定性和有机溶剂稳定性的影响。方法：以构建好的克隆质粒pGH-T/lasB为模板，通过定点突变（I38T、A69T和N266T），在重组弹性蛋白酶氨基酸序列中引入三个N-糖基化位点。利用突变引物进行PCR扩增以得到突变质粒；通过基因剪切与连接将突变的lasB基因亚克隆到表达质粒pPIC9K上；电转化到毕赤酵母中并诱导表达。经纯化获得重组弹性蛋白酶，并对N-糖基化修饰与重组弹性蛋白酶稳定性之间的关系进行了研究。结果：I38T和N266T突变对重组弹性蛋白酶的N-糖基化水平显著地提高了。而I38T突变降低了该酶的热稳定性，N266T突变对此却基本没有影响；I38T和N266T突变无明显影响对酶在有机溶剂中的稳定性。

关键词：N-糖基化，定点突变，弹性蛋白酶，毕赤酵母

Abstract: Objective: Three N-glycosylation sites were introduced into rPAE by site-directed mutagenesis. Whether N-glycosylation had an effect on the thermal stability and solvent stability of rPAE was analyzed. Methods: Using plasmid pGH-T/lasB as template, three N-glycosylation sites (I38T, A69T and N266T) were introduced into rPAE by site-directed mutagenesis;Mutation primers were used to obtain the plasmid mutation; The mutated lasB was subcloned into the expression plasmid pPIC9K by gene shear and connection; The plasmid was then transformed into Pichia pastoris by Electroporation. Purified recombinant elastase was collected, and the relationship between N-glycosylation and the thermal stability and solvent stability of rPAE was analyzed. Results: Compared with the wild-type rPAE, the glycosylation levels of N266T and I38T mutant protease were considerably enhanced. The I38T mutation reduced the thermal stability of the enzyme, while N266T mutation affected that slightly. Both I38T and N266T mutations had no significant effects on the rPAE solvent stability.

Key words: N – glycosylation, Site-directed mutagenesis, Pseudolysin, Pichia pastoris

目 录

引言： 5

1 实验材料及仪器 8

1.1 酶、菌株与质粒 8

1.2 试剂与溶液 8

1.3 实验仪器 8

2 实验方法 8

2.1 定点突变 9

2.2 目的基因的亚克隆 10

3 实验流程 11

3.1 基因定点突变 11

3.1.1 引物设计 11

3.1.2 原突变位点附近基因序列 11

3.1.3 引物序列 12

3.1.4 聚合酶链式反应 12

3.2 感受态制备和目的基因的转化 13

3.2.1 大肠杆菌感受态制备 13

3.2.2 目的基因的转化 13

3.2.3 提取质粒并测序 13

3.3 目的基因的亚克隆 13

3.3.1 乙醇沉淀DNA 13

3.3.2 酶切 14

3.3.3 目的基因的连接 14

3.3.4 再次转化筛选 14

3.4 诱导产酶 14

3.4.1 毕赤酵母电转化方法 14

3.4.2 菌体的准备 14

3.4.3 电击转化 15

3.4.4 诱导产酶培养 15

3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 15

3.5.1 染色和脱色 15

3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 15

3.6.1 酶蛋白在对温度的稳定性 16

3.6.2 酶蛋白在有机溶剂中的稳定性 16

3.7 酶蛋白的纯化 16

3.7.1 重组蛋白酶的纯化 16

4 结果与讨论 16

结论 21

参考文献 22

致 谢 23

引言：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，是人体典型机会致病菌，在烧伤、免疫缺陷、器官移植及一些医院感染病人中引起严重感染，严重危害大家的健康和生命，威胁到整个社会的稳定。该菌可以产生多种有害的致病性物质，其中的弹性蛋白酶，其英文术语为pseudolysin，该蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为主要特征的蛋白水解酶，在医学临床主要用于高血脂症，防止动脉粥样硬化等疾病的治疗。也可用于肉类和水产加工中的嫩化。弹性蛋白酶属基质金属蛋白酶中的第4族，由lasB基因编码，为胞外分泌型蛋白酶，该基因编码区全长1497bp,编码蛋白为498个aa，其中1-23位aa为信号肽，24-498位aa为前弹性蛋白，该蛋白在胞外分泌过程中通过细菌外膜后，在197位的His(H)与198位的Ala(A)之间，通蛋白酶切割，活性成熟蛋白为靠近C-端的301个氨基酸残基^[1]。其成熟蛋白分泌至胞外，降解病灶细胞外基质，在铜绿假单胞菌感染过程中起重要作用。因此，获得纯化的弹性蛋白酶，对于研究其致病机理，具有重要意义。

弹性蛋白酶医疗上具有很高的应用价值，同时它在食品工业、日用化学工业中具有很好的前景，具有较高的商业和应用价值^[2-4]。在医药产品方面，具有维持纤维血管正弹性的独特功能，对治疗高血脂等症疗效显著；对于治疗和预老年心血管病、增进中老年人身体健康水平具有重要意义。除此之外，该酶外用还用于有效治疗烧伤病患及皮肤溃疡等一系列病症；在食品工业上，利用弹性蛋白酶能降解许多动、植物蛋白，可用它来进行农副产品的深加工，制作高蛋白食品，并可在加工业等方面得到广泛应用。同时弹性蛋白酶能够专一降解结缔组织中比较坚韧的弹性纤维组分，因而可作为理想的肉类嫩化剂；在日用化学工业上弹性蛋白酶认为能起增进、改善皮肤的血液循环的作用，并能改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性和延缓皮肤老化，减少皱纹及色素在体内的沉积，还能促进毛发的生长，可以有效的防止脱发、掉发^[5]。

我国的弹性蛋白酶通常的制备方法是由用水提取动物的胰脏部位而得^[6]。或者通过直接从细菌培养上清中提取弹性蛋白酶，但是产量低、纯化困难，不能很好地满足研究工作和市场需要^[7]。现在我们试着利用微生物发酵表达，通过一系列生物化学手段来解决这一问题^[8]，如果利用基因工程手段建立表达性工程菌以大量制备高纯度弹性蛋白酶，将为对该酶的进一步研究和开发提供良好基础。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：17929字