论文总字数：13541字

摘 要

弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱肽链内切酶，广泛应用于医疗卫生、食品加工、日用化工及环境治理等行业，具有极大的经济价值和应用前景。本研究主要是通过利用基因定点突变等分子生物学手段去除N-糖基化位点I38T、A69T和N266T，来研究N-糖基化位点对毕赤酵母表达的重组弹性蛋白酶活性的影响，并得到酶活更高的突变类型I38T。

关键词：N-糖基化，弹性蛋白酶，定点突变，毕赤酵母

Abstract: Elastase is a kind of broad spectrum endonuclease peptide chain, which is characterized by hydrolysis of insoluble elastin. It is widely used in many industries such as health care, food processing, household chemicals, and environmental management. It has great economic value and application prospect. Mainly through the gene site-directed mutation and other molecµLar biological methods to remove N-glycosylation sites I38T, A69T, and N266T, this paper attempts to study N-glycosylation sites′ influences on the recombinant elastase activity of Pichia pastoris yeast expression and to obtain a mutant type I38T with higher enzyme activity.

Keywords: N-glycosylation , elastase, site-directed mutagenesis, Pichia pastoris

目录

1 前言 6

2 材料和方法 7

2.1 材料 7

2.1.1 质粒和菌株 7

2.1.2 培养基 7

2.1.3 酶和试剂 7

2.2 方法 8

2.2.1 含有目的基因质粒的提取 8

2.2.2 引物设计和PCR扩增 8

2.2.2.1 引物设计 8

2.2.2.2 PCR基因定点突变 8

2.2.3 感受态的制备和质粒转化与扩增 9

2.2.3.1 感受态的制备 9

2.2.3.2 质粒转化 9

2.2.4 构建其余突变菌株 10

2.2.5 构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K及转化筛选 10

2.2.5.1 构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K 10

2.2.5.2 转化筛选 11

2.2.6 重组后pPIC9K对毕赤酵母进行转化 11

2.2.7 重组毕赤酵母菌株的诱导表达与产酶的纯化浓缩 12

2.2.8 SDS-PAGE检测及酶活测定 12

3 结果和讨论 12

3.1 含有目的基因的克隆质粒PCR定点突变 12

3.2 克隆质粒转入受体细胞大量繁殖 13

3.3 乙醇沉淀DNA法浓缩克隆质粒 13

3.4 重组质粒的双酶切鉴定 14

3.5 重组表达质粒pPIC9K的鉴定 14

3.6 重组毕赤酵母的转化和诱导产酶 15

3.7 酶液的纯化和SDS-PAGE的鉴定 15

3.8 转化子酶活测定及高产菌株的筛选 16

结论 16

参考文献 18

致谢 20

1 前言

弹性蛋白酶psudolysin是由Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）产生的弹性蛋白酶，又名Pseudomonas aeruginosa elastase（PAE），它是一种以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶^[1]。该酶在铜绿假单胞菌中由lasB基因编码是一种中性锌金属蛋白酶，需结合锌离子发挥其活性，结合钙离子维持其稳定性。lasB基因全长1497bp，编码498个氨基酸。弹性蛋白酶是一种胞外蛋白酶, 在细胞质中以弹性蛋白酶原前体的形式存在, 在穿过内膜时，信号肽被切割分泌到胞外后，蛋白酶自我切除前导肽，成熟产物为301个氨基酸，分子量为33kDa。弹性蛋白酶在可以降解自然界中化学性质稳定的蛋白类物质：比如，动物弹性蛋白、动物毛发、禽类羽毛和水产养殖业产生的废弃蛋白质。因此，该弹性蛋白酶在农业、养殖业等行业中产生的废弃的、难以水解的蛋白类物质有着良好的应用前景^[2]。铜绿假单胞菌是条件致病菌的，这种微生物在代谢过程中会产生绿脓素等有致病性的次生代谢产物。所以，直接利用这种微生物通过生物转化来利用废弃角蛋白类、弹性蛋白类含氮源农副产品是存在着严重的生物安全性的问题。同样，该菌株的致病性和该菌产生次生代谢产物的不安全性将限制通过这种菌株来发酵生产弹性蛋白酶的工业化生产过程。因此，将lasB基因在安全、高效的宿主里表达是将弹性蛋白酶广泛应用的前提。

自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来，作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，它还具有以下的优势： 

（1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；  

（2）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；  

（3）外源蛋白基因遗传稳定。外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够到高表达菌株； 

（4）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

目前已筛选到高产弹性蛋白酶的菌株Pseudomonas aeruginosa C11，并且该菌株的lasB基因已经成功在毕赤酵母中成功高效表达，并对重组蛋白进行了纯化和研究。另外，该弹性蛋白酶中存在三个N-糖基化位点（I38T、A69T和N266T），本研究主要就是通过基因定点突变去除糖基化位点，来研究其对重组弹性蛋白酶活性的影响，总共包含7种突变菌株，分别为包含定点突变I38T，A69T，N266T，I38T/A69T，I38T/N266T，A69T/N266T和I38T/A69T/N266T突变类型的菌株。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 质粒和菌株

含有目的基因的Pseudomonas aeruginosa C11菌株有论文导师韩铭海老师提供；大肠杆菌感受态DH5α购自上海捷瑞生物工程有限公司；克隆质粒pGH-T质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司；毕赤酵母表达质粒pPIC9K购自上海捷瑞生物工程有限公司，有本实验室保存。

2.1.2 培养基

1. LB培养基（1L）：胰蛋白胨（Tryptone）10g、酵母提取物（Yeast extract）5g、氯化钠（NaCl）10g、pH7.0左右。
2. YPD培养基（1L）：10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，若制固体培养基，加入20g琼脂粉，自然pH。
3. BMGY培养基（1L）：15g酵母膏，20g蛋白胨，10g甘油和100mmol/L的pH6.0磷酸钾缓冲液，4×10^-4g生物素。（4×10^-4g生物素：每100mL培养基添加0.2mL 0.02％的生物素，生物素是预先过滤除菌的。）
4. MD培养基（1L）：13.4g酵母基本氮源（YNB），4×10^-4g生物素和20g葡萄糖，自然pH，若制固体培养基，加入20g琼脂粉。（YNB：每100mL添加13.4％的YNB，YNB是预先过滤除菌的）

2.1.3 酶和试剂

限制性内切酶EcoRI、AvrII和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，Pfu DNA高保真聚合酶购自生工生物工程（上海）有限公司，SacI酶购自Thermo公司，DNA Marker DL10001、DNA Marker DL2501和DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

2.2 方法

2.2.1 含有目的基因质粒的提取

参照上海捷瑞生物工程有限公司质粒小量制备试剂盒（离心柱型）使用说明书利用碱裂解法提取已含有目的基因片段的克隆质粒。

2.2.2 引物设计和PCR扩增

2.2.2.1 引物设计

自从1985年Karny MµLlis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一^[3]，引物设计也是PCR过程中的一个重要环节。引物设计有3条基本原则:一是引物与模板的序列要紧密互补；二是引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；三是引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)^[4]。本论文课题主要是通过查正相关文献及数据库设计的引物^{[5 , 6]}，引物序列如下（带下划线部分表示突变的位点）：

（1）、 I38Ts：5′－CGACGGCAACGTCACCACCGTCGACATGA－3′

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