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摘 要

本实验从淮阴师范学院食堂土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定以及生理生化鉴定，并通过明胶试验、吲哚试验、耐盐试验、VP试验、糖发酵试验等生理生化实验对所筛选的菌种进行鉴定，根据伯杰式细菌学手册鉴定其种属。最后鉴定结果为蜂房芽孢杆菌。

关键词：稀释涂布，水解圈，淀粉酶，芽孢杆菌，生化鉴定

Abstract: The experiment was to isolate Bacillus from soil, Huaiyin Normal University canteen producing amylase and to study its identification, preservation, purification, morphological, physiological and biochemical identification of strains and to identify the strains by gelatin test, indole test, salt test, VP test, sugar fermentation tests and other physiological and biochemical experiments. Then we identified the bacteria which were screened about its species according to Bergey"s Manual of Bacteriology style. Finally, the identification of the result was the Bacillus alvei.

Key words: dilution coated, hydrolyzed circle caused, amylase, Bacillus, biochemical identification

目 录

1 前言 3

2 实验材料与方法 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 土壤 4

2.1.2 试剂 4

2.1.3 仪器 4

2.1.4 培养基及条件 4

2.2 实验方法 5

2.2.1 土壤悬液样品制备 5

2.2.1.1 土壤悬液制备 5

2.2.1.2 土壤悬液稀释 6

2.3 分离纯化 6

2.3.1 菌株的纯培养 6

2.3.2 产淀粉酶菌株的筛选 6

2.3.3 单染色镜检步骤： 6

2.3.4芽孢染色镜检步骤： 6

2.3.5 菌株保藏 7

2.4 初步鉴定 7

2.4.1 形态学鉴定 7

2.4.2 生理生化鉴定 7

2.5 菌种鉴定 8

3 结果与讨论 9

3.1 分离纯化 9

3.1.1 菌株的初筛 10

3.2 初步鉴定 10

3.2.1 形态学鉴定 10

3.2.2 生理生化鉴定 10

结 论 13

参 考 文 献 14

致 谢 15

1 前言

淀粉酶为能水解淀粉和糖原的酶，大都存在于动物，植物，微生物中，是最早实现工业化生产，而且是到目前为止产量最大、用途最广的酶制剂品种^[1]。从上世界60年代以来，通过酶法生产葡萄糖，淀粉酶的需要量与日俱增，几乎占整个酶制剂产品总产量的一半以上^[2]。如今，工业上最主要采用微生物发酵法生产淀粉酶制剂^[3]。通过淀粉酶，催化并水解织物上的淀粉浆料，因为淀粉酶的高效性以及专一性，所以酶退浆快，不损伤纤维，污染少，碱法更柔软，退浆率高等特点受到了广泛的应用。淀粉酶种类繁多，特点各异，多用于工业副产品、果汁和食品加工^[4]、医药、印染、发酵、造纸、洗涤剂^[5]及废料的处理、微生态制剂^[6]等多种领域，它是目前国内产量最大、外应用最广的酶种之一^[7,8]。

淀粉酶还可以分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。α-淀粉酶多存在于动植物以及微生物中^[9]。我国α-淀粉酶剂型品种和生产菌株都很单一^[10]。淀粉酶中大多数都以Ca² 为必需因子并且能作为稳定因子与激活因子，还有一部分淀粉酶是非Ca² 依赖型。淀粉酶对直链淀粉和支链淀粉作用，没有差别地任意切断糖链内部的α-1，4-链。因此淀粉酶的作用为引起底物溶液浓度的快速降低和碘反应的消失，它在分解直链淀粉时，最终产物以葡萄糖为主，另外，还有少数麦芽三糖以及麦芽糖。α-淀粉酶广泛应用于燃料酒精、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业^[11]。另外一方面在分解支链淀粉时，除了葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖外，还产生分支部分，有α-1，6-键的α-极限糊精。分解限度拿葡萄糖为标准一般为35-50%，但是于细菌的淀粉酶中，也有高达70%分解限度。

β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于，β-淀粉酶是从淀粉非还原性末端，以麦芽糖为单位依次切断α-1，4-葡聚糖链。β-淀粉酶作用于支链淀粉或葡聚糖的时，切断至α-1，6-键的前面时反应就停止了，因此会生成分子量比较大的极限糊精。从以上所述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用点与作用方式，分别提出了α-1，4-葡萄糖水解酶和α-1，4-葡聚糖-麦芽糖水解酶等名称。

微生物的许多种类都能产生淀粉酶，Buchanan和Tamuri等人表达了数百种嗜热真菌和上千种细菌，可以产生淀粉酶，仅仅芽孢杆菌属48个种里就有32个种能够产生α-淀粉酶^[12]。淀粉酶种类繁多，特点各异，淀粉酶对淀粉的分解作用是生物体用淀粉进行新陈代谢的初级反应，就是工业上利用淀粉为依据^[13,14]。它应用于果汁、印染、造纸、酿造与医药、工业副产品、食品加工、洗涤剂以及废料的处理，微生态制剂等多种领域^[15]。如今所得淀粉酶活力最高可到达260U/mL左右。虽然有很多微生物都能产生淀粉酶，但是适合商业生产锁需的菌株很少，在淀粉酶生产的过程中，选择合适的菌株为最重要的前提条件。本文主要研究了土壤中产α-淀粉酶生产菌的筛选及并对这种高产菌株进行了初步的鉴定并且分析，为菌株的实际生产应用奠定了初步的研究基础。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 土壤

在学校食堂附近土壤以五点采样法来采集土壤样品，每一个土样25g左右（每个点为5g）。把土样放入无菌的纸袋中，并且记录采集的时间和地点，放置于4℃冰箱中保存备用。分别记做A土样、B土样。

2.1.2 试剂

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