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摘 要

该试验在单因素对里氏木霉产纤维素酶的液体培养基优化的基础上，以滤纸酶活力为响应值，采用响应面法优化确定其最佳培养基成分和条件。首先通过Plackett-Burman（PB）设计筛选出影响滤纸酶活的显著因素，得出对滤纸酶活影响显著的因素为麸皮、温度、氯化钙；通过最陡爬坡试验逼近最大酶活力区域；最后通过Box-Benhnken设计及响应面分析确定产纤维素酶的最佳培养基成分及条件。结果表明，在以麸皮作为碳源，硫酸铵作为氮源，并且在PH为5.5，温度为31℃，接种量为5％的条件下发酵培养5d时，发酵产生的纤维素酶滤纸酶活最大，为60.126U/ml。通过优化实验，里氏木霉达到了较高的产纤维素酶活力，为纤维素酶进一步用于工业化生产奠定了基础。

关键词：响应面法，里氏木霉，纤维素酶，培养条件优化

Abstact: Using filter paper activity (FPA) as response values, response surface methodology was used to optimize liquid-state fermentation medium for cellulase production by Trichoderma reesei . Plackett-Burman design was further adopted to screen the important factors affecting FPA , which were wheat bran, temperate, and CaCl_2. The steepest ascent experiment was used to approach the optimal region of the highest FPA. The optimal fermentation medium obtained by Box-Benhnken and response surface analysis was as follows. The optimum conditions for the cellulase production by the Trichoderma reesei were as follows: celluloses as the carbon source, (NH₄)SO₄ as the nitrogen source, the initial pH of 5.5, inoculum concentration 5% ,fermenting at 31 ℃ for 5 d. Under the optimized conditions, the enzyme activity of the cellulase was as highest as.

Keywords: Response surface methodology, Trichoderma reesei , cellulase , fermentation condition optimization

目 录

1 前言 3

2实验材料与方法 4

2.1菌种 4

2.2培养基 4

2.3主要仪器和试剂 4

2.4实验方法 5

2.5发酵产酶培养基的优化 6

3结果与分析 7

3.1葡萄糖标准曲线的配置 7

3.2单因素实验 8

3.3 Plackett-Burman 设计法筛选重要因素 11

3.4最陡爬坡实验 12

3.5 Box-Benhnken设计 13

3.6该菌株最佳培养条件的确定及其验证实验 18

结 论 19

参考文献 20

致谢 21

1 前言

如今，生物能源成为生化界的一大潮流，例如，用生物质来生产生物乙醇，不仅污染小，而且使得废弃的农作物得以充分利用，更重要的是生物乙醇的开发利用缓解了石油资源的匮乏。那么，如何更好地利用生物能源成为关键性的问题。然而，生物能源利用最主要的问题就是纤维素的降解。为了更好的利用纤维素，则需要大量的纤维素酶，但是纤维素酶的应用成本相对较高^[1-2]，如何开发低成本的纤维素酶仍在探索中。本实验的目的就是想通过优化里氏木霉产纤维素酶培养条件来找到该菌株的最佳产酶条件，从而为后期的大规模生产纤维素酶奠定基础。

纤维素酶是降解产生纤维素的一组酶的总称，能降解和利用纤维素的微生物大致可分为真菌类和细菌类。纤维素酶包括内切葡聚酶（EG）、外切葡聚酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）三种酶 ^[3-4]。纤维素酶的3类组分对纤维素的确切酶解机制还不完全确定，目前，普遍接受的纤维素的降解机制是协同作用模型，即CBH酶破外纤维素的结晶结构，作用于不溶性纤维表面，使纤维素结晶链开裂，长链纤维素分子末端部分游离和暴露，使纤维素易于水化，经CBH酶作用后的纤维素分子结晶结构被破坏，EG酶即吸附在纤维素分子上面，从键的内部任意位置切开β-1,4-糖苷键，将纤维素分子断裂为纤维二糖和纤维三糖等^[5-6]。最后这些被裂解产物由β-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。

响应面优化法，即响应曲面法（Response Surface Methodology ,RSM），包括试验设计、建立模型、分析模型合理性和寻求最优解等众多试验与统计技术。响应面分析法是降低开发成本、优化实验条件、提高生产效率、解决生产实际问题的更为有效地方法^[7-10]。该法在生物发酵方面已有广泛应用。本实验采用Design-Expert软件中的Plackett-Burman设计法、最陡爬坡实验和响应面分析法（RSM）相结合的设计对本实验里氏木霉菌株进行摇瓶发酵培养基的优化，为纤维素酶的生产提供理论基础。

2实验材料与方法

2.1菌种

里氏木霉（Trichoderma reesei）由本实验室保藏。

2.2培养基

2.2.1 试管斜面培养基

马玲薯琼脂(PDA)培养基：取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水l 000 ml煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1 000 ml，加葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，溶化后分装，12l℃灭菌30 min，25℃培养6d后使用。

2.2.2 种子培养基（g/L）

PDA液体培养基

2.2.3 发酵产酶培养基

麸皮 2g，KH₂PO4 ₂g，(NH4)₂SO₄ 1.4g，MgSO₄ 0.3g，CaCl₂ 0.3g，FeSO4·7H₂O 5mg，MnSO₄ 1.6mg，ZnCl₂ 1.7mg，CoCl₂ 2.0mg，溶于1000ml 蒸馏水中，自然pH。

2.3主要仪器和试剂

仪器：

苏州净化SW-CJ-2D型（实用垂直新颖）双人单面净化工作台、EPED实验室级超纯水器、HYG-C型多功能摇床、恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌锅、低温冰箱、PH计、UV759紫外-可见分光光度计、250ml锥形瓶、培养皿、接种环

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