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摘 要

以里氏木霉Trichoderma reesei 基因组 DNA 为模板，采用外显子拼接的方法，克隆出内切β-1，4 -D-葡聚糖酶Ⅱ基因egl2 的全编码序列，通过PCR成功扩增出包含两段外显子的基因序列，平端连接到pHG-T simple载体上，通过一步法和CaCl2法两种方法转化大肠杆菌DH5a感受态，并进行两种方法的比较。转化成功的菌株提取出质粒提后送往深圳华大基因测序，并将序列与已有序列进行clustalx比对分析。为内切β-1，4-D-葡聚糖酶II的进一步研究奠定基础。

关键词：里氏木霉；纤维素酶；基因克隆； clustalx比对

Abstract:

In my study, the complete sequence encoding of the endo-1,4-glucanase II was amplified by the method of exons connecting, useing the Trichoderma reesei genomic DNA as a PCR template.

Two exons gene was connected to be the target gene by three times PCR amplifications which used to connected with the pHG -t simple vector. one step method and the method of CaCl2 was both used in transforming into competent E.coli DH5a.The two method was compared each other after the results.The plasmid extracted from successful strain sent to BGI to sequencing, and compare with the existing sequences by clustalx.

Keywords：Trichoderma reesei，Cellulase, gene clone，clustalx alignment

目录

摘要 3

1前言 7

1.1纤维素酶的概述 7

1.1.1纤维素酶的分类及降解机制 7

1.1.2纤维素酶的结构 8

1.2里氏木霉的概述 8

1.2.1里氏木霉产纤维素酶的概况 8

1.2.2里氏木霉的研究动态 9

2材料与方法 9

2.1材料 9

2.1.1质粒和菌株 9

2.1.2主要仪器及设备 9

2.1.3酶和主要试剂 10

2.2试验方法 10

2.2.1主要试剂以及培养基的配制 10

2.2.2里氏木霉的活化培养 10

2.2.3里氏木霉菌体的分离 10

2.2.4里氏木霉总DNA的提取 11

2.2.5引物设计和pcr扩增特定片段基因 11

2.2.6基因片段切胶回收 13

2.2.7感受态大肠杆菌制作 14

2.2.8目的基因片段转与质粒连接 14

2.2.9转化大肠杆菌DH5a感受态。 14

2.2.10转化成功质粒提取酶切跑胶验证 15

2.2.11质粒测序并进行Blast比对分析 15

3结果与分析 15

3.1里氏木霉酶基因组的提取 15

3.2 PCR 扩增 15

3.2.1外显子E1扩增 15

3.2.2外显子E2扩增 16

3.2.3E1 E2切胶回收 16

3.2.4全基因克隆 17

3.2.5里氏木霉内切-1，4-β-D-葡聚糖酶II基因胶回收验 17

3.3里氏木霉内切-1，4-β-D-葡聚糖酶II基因的克隆 18

3.3.1目的基因片段转与质粒连接 18

3.3.2转化大肠杆菌DH5a感受态 18

3.3.3重组质粒的提取鉴定 19

3.4重组质粒的测序鉴定和分析 20

结论 24

参考文献 25

致谢 27

1前言

1.1纤维素酶的概述

纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用。是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）。

细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素无降解活性，且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，因此对细菌的研究较少。而真菌纤维素酶产量高、活性大，研究的也较多。

目前，能源短缺问题已经成为制约经济社会的持续发展的关键，人类开始积极探索可代替的新能源^[1]。然而，每年生物质净产量约为1800亿吨。自然界中以纤维素类形式存在的生物质储存了大量太阳能，是重要的能源和资源。植物细胞壁有三种基本的结构上的生物分子组成:纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素是地球上最丰富的生物高聚物。在组织中被认为是微晶结构。在生物量发酵转化成燃料和化合物过程中，纤维素分解成游离葡萄糖是主要步骤之一。

纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。纤维素酶在能源行业、食品发酵行业和环境行业已经均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。在纤维素发酵产乙醇的过程中，分步降解纤维素并最后发酵成乙醇，纤维素酶起了至关重要的作用。

1.1.1纤维素酶的分类及降解机制

纤维素酶系是一类由降解方式不同的3类酶组成:(1)内切葡聚糖酶(endol，4-p-Dglucaiiase， EC3.2.1.4，简称 EG或称为 Cx 酶);(2)外切葡聚糖酶(exol，4-p-Dglucanase， EC3.2.1.91，简称 CBH或称为 C1 酶);(3)p-葡萄糖苷酶(p-glucosidase， EC3.2.1.21，称 BG 或纤维二糖酶)，三种酶通过协同作用降解纤维素^[2]。

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