论文总字数：11037字

摘 要

为了选育高产纤维素酶生产菌达到缓解纤维素酶短缺的现状。利用实验室保藏的黑曲霉W1为出发茵株，经过紫外线和常压室温等离子体复合诱变，选育出高产纤维素酶菌株。在适宜的条件下，通过复合诱变得到的黑曲霉突变株M2的酶活明显提高，突变株M2在30^oC，150r/min培养72h后羧甲基纤维素钠酶活最高达到26500 U·g^-1，出发菌株W2培养72h酶活达到10900 U·g^-1，突变株较出发菌株酶活力提高2.43倍。黑曲霉诱变菌株具有较强的分泌纤维素酶的能力。

关 键 词：黑曲霉，纤维素酶，酶活力，诱变

Abstract: The research aimed to breed the high-yield production strain of cellulose to alleviate the shortage of cellulase. Laboratory preservation of Aspergillus niger W1 was used as the starting strain, and a high-yield production strain of cellulase was selected after compound mutation of UV and ARTP. Under the suitable condition, the CMC vitality of W2 strain through compound mutation improve significantly, and the enzyme activity of mutant strain W2 was highest (26500 U·g^-1) after culture 72h with 150r/min at 30^oC and that of starting strain reached 10900 U·g^-1 after culture 72h. The CMC vitality of W2 strain selected could be 143% higher than that of starting strain. The mutant strain of A.niger had stronger ability of secreting cellulase.

Keywords：Aspergillus niger, Cellulase, Enzyme activity, Mutation

目录

摘 要 3

1 前言 6

2 材料与方法 8

2.1 材料 8

2.1.1 出发菌株 8

2.1.2 仪器 8

2.1.3 培养基 8

2.2菌种活化 8

2.3方法 9

2.3.1孢子悬液的制备 9

2.3.2 菌株诱变处理 9

2.3.2.1 紫外线诱变 9

2.3.2.2 ARTP等离子体诱变 9

2.3.3 诱变菌种的筛选 9

2.3.4 酶活的测定 10

2.3.4.1 粗酶液的提取 10

2.3.4.2 羧甲基纤维素酶活力的测定 10

2.3.4.3 纤维素酶滤纸活性的测定 10

3. 结果与分析 11

3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 11

3.2 不同紫外线诱变黑曲霉黑曲霉致死率统计结果 11

3.3 不同时间ARTP等离子体诱变时间黑曲霉致死率统计结果 12

3.4出发菌株与突变株的纤维素酶活比较 13

结论 14

参考文献 15

致谢 17

1 前言

随着化石燃料的短缺，如今，能源成为人类面临的共同问题。寻找新的能源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。地球上每年光合作用产生大于100亿t植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素^[1]。纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质, 可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。纤维素分解的研究对纤维素资源的开发利用具有重要意义。自然界中广泛存在产纤维素酶的微生物，包括细菌、真菌、放线菌等都可以生成纤维素^[2]。应用于纤维素酶生产的只有木霉属、曲霉属、青霉属、镰孢菌属等菌种,这些菌株可以通过基因工程生产出高活性的纤维素酶^[3]，也可以通过各种物理和化学诱变产生能稳定遗传的纤维素酶高产菌株。

纤维素酶在动物和微生物体内存在很广泛，它是一种复合酶，是由起协同作用的三个主要成分葡萄糖内切酶、葡萄糖外切酶、β-葡萄糖苷酶组成的诱导复合酶系，还有很高活力的木聚糖酶活力。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，对纤维素酶的需求正日益增大，纤维素酶制剂供不应求。目前纤维素酶已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，其前景十分广阔甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。纤维素类物质是地球上存在的最丰富的天然有机质。利用微生物发酵产生纤维素酶，将纤维素类物质转化为人类急需的能源，已成为纤维素类资源再生利用研究的热点^[4]。但是，直接从天然环境中选育出的野生菌株活性不高稳定性不好，菌种易退化，很难工业应用。因此，选育高产纤维素酶的菌株，提高纤维素酶的活性和稳定性，对于破解生物质能源工业化的瓶颈具有非常重要的意义。由于野生型菌种的纤维素酶活力不高,因此,利用各种诱变手段寻找和开发高活力、发酵周期短的纤维素酶高产菌优良菌株制约着纤维素资源能否高效利用。

王小顺等对利用紫外线和亚硝基胍对黑曲霉出发菌株进行复合诱变，测定了蛋白酶活性、果胶酶活性和纤维素酶活性，结果显示：每克鲜曲中酸性蛋白酶酶活性、果胶酶、纤维素酶分别比出发菌株提高97.9%、70.1%和13.4%。并且经过斜面传代培养表明酶活的稳定性很好^[5]。许志等为了得到高产纤维素酶的菌株，从自然界中筛选出较优良的产纤维素酶菌株并对其进行紫外线、⁶⁰Co-γ射线诱变选育获得高产纤维素酶活的突变株，其CMCase酶活和PFAase酶活分别达到66.15IU/mL和2.91IU/mL，是出发菌株的3.17倍和2.42倍^[6]。

黑曲霉Aspergillus niger亦称无花果曲霉，作为一种常用的工业生产菌株，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉不仅是公认的安全菌株,而且也是产纤维素酶能力较强的微生物之一^[7],因此,我们选用黑曲霉为出发菌株。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。

该实验以实验室保存的黑曲霉为出发菌株，用紫外线和ARTP等离子体对黑曲霉进行复合诱变。在诱变选育时，利用透明圈法在羧甲基纤维素钠培养基中分离出纤维素水解圈与菌落直径之比大于1.5(Hcgt;1.5)较大的3株纤维素酶产生菌，纤维素水解圈与黑曲霉产酶活性有一定关系，产酶活性越高，产酶量越多，透明圈越大^[8]。但是H_C较大的菌落与其发酵产酶的酶活不一定呈正相关，可能是除了透明圈测定法不够精确外，还存在突变株性状不稳定的原因^[9]。对于黑曲霉的诱变选育，一般以紫外线和化学诱变为主，笔者的研究采用紫外线和常压室温等离子体诱变，诱变手段新颖，而且经过此复合诱变的黑曲霉产纤维素酶活比以紫外线和化学诱变选育的菌株酶活高。

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