论文总字数：12214字

摘 要

近年来，作为一种优秀的工业微生物，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）而受到越来越多的关注，因为它的生长速度要比其他真核微生物要明显的快、并且热稳定性也好很多、能利用多种糖发酵生产乙醇的特性。本文通过利用测定纤维素酶的β-葡萄糖苷酶的酶活，以及CMC酶活和FPA酶活来测定马克斯克鲁维酵母纤维素酶活。纤维素酶活是纤维素酶的很重要的指标之一，是用来指标酶解纤维素能力大小。只有全面掌握纤维素酶活的测定技术，然后在面对纤维素酶和纤维素的极其复杂的结构体系时，才能准确获得纤维素酶的活力。

关 键 词 ：马克斯克鲁维酵母，纤维素酶活力测定

Abstract：In recent years, as a good industrial microbiology, marxianus (Kluyveromyces marxianus) for its fast growth in other eukaryotic microorganisms, good thermal stability, can take advantage of a variety of sugar fermentation characteristics of ethanol and subjected to increasingly the more attention [9]. In this paper, the determination of CMC cellulase enzyme activity and FPA to determine Kluyveromyces marxianus cellulase activity. Cellulase activity is an indicator of the size of the capacity of cellulose hydrolysis is an important characteristic of the cellulase. Since cellulose and cellulose are extremely complex architecture, so only fully grasp the cellulase activity measurement technology to accurately obtain cellulase activity.

Keywords：Kluyveromyces marxianus, Determination of cellulase activity

目录

1. 前言………………………………………………………………………… 6
2. 材料和方法………………………………………………………………… 7

2.1 材料……………………………………………………………………… 7

2.1.1 供试菌体……………………………………………………………… 7

• • 1. 主要仪器……………………………………………………………… 7

2.1.3 培养基(质量分数,%)………………………………………………… 7

2.1.4 相关溶液……………………………………………………………… 8

• 1. 方法……………………………………………………………………… 8

2.2.1 培养方法……………………………………………………………… 9

• • 1. 酶液制备……………………………………………………………… 9
    2. 酶活测定……………………………………………………………… 9

1. 结果……………………………………………………………………… 14
   1. 葡萄糖标准曲线……………………………………………………… 14
   2. pNP标准曲线………………………………………………………… 15
   3. β-葡萄糖苷酶活力………………………………………………… 16
   4. 羧甲基纤维素酶活力………………………………………………… 16
   5. 滤纸酶活力…………………………………………………………… 16

结论…………………………………………………………………………… 17

参考文献……………………………………………………………………… 18

致谢…………………………………………………………………………… 19

1. 前言

纤维素不仅在地球上分布大，且碳水化合物含有量最丰富，它的降解是自然界碳素循环的最主要的环节。纤维素的利用和转化对于解决目前世界各种危机和污染问题具有十分重要的意义。纤维素酶在很多行业都起着非常重要的作用^[1] 。自从它被发现和了解以后。由于纤维素是由800~1200个葡萄糖分子聚合而成的，但很少部分现在能被利用。如利用纤维素酶将纤维素降解成可被人类利用的糖无疑是开辟了一个新的能源来源^[2-3]。纤维素酶的工业化 ，生产分两种方法，分别是固体发酵法和液体深层发酵法。液体深层发酵法由于其培养条件容易控制,不易污染杂菌, 并且生产效率高等优点,成为国内外重要的研究和生产工艺^[4-5]。

纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成^[6-7]。在这3种酶的协同作用下能有效将纤维素水解成葡萄糖，每一种酶的活性都会影响整个纤维素酶的活性。在真菌中产纤维素酶活力较高木霉、黑曲霉、青霉等是真菌中产纤维素酶活力较高。利用纤维素酶可开发丰富的纤维素资源,纤维素酶在纺织、酿造、造纸、食品、饲料、造纸、农产品加工、资源再生等方面都有广泛的应用前景^[8-10]。

近年来，作为一种优秀的工业微生物，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）而受到越来越多的关注，因为它的生长速度要比其他真核微生物要明显的快、并且热稳定性也好很多、能利用多种糖发酵生产乙醇的特性^[11]。最近，Hong等人使用表达了耐热纤维素酶基因的马克斯克鲁维酵母来利用纤维二糖发酵产酒精，100g/L纤维二糖可以在24小时内转化为43.4g/L乙醇^[12]。另外，马克斯克鲁维酵母是天然的菊粉酶的主要来源，能够向胞外分泌较高活力菊粉酶。一株新分离到的马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）菌株YS-1在1.5L釜式反应器中，200 rpm搅拌速度，0.75L/min通气量的发酵条件下发酵60 h得到55.4 U/mL的菊粉酶活力。在另一个研究中，同样的酵母菌株在用4.0%芦笋根茎中得到的粗菊粉作为产酶培养基，在30°C、200 rpm搅拌速度、0.75L/min通气量的发酵条件下发酵60h得到50.2U/mL的菊粉酶活力。在生物反应器中的菊粉酶活力几乎是在摇瓶培养中使用最初基本培养基时的6倍^[11]。马克斯克鲁维酵母的基因组中本身具备β-葡萄糖苷酶基因，可以向胞外分泌一定量的β-葡萄糖苷酶，能够在以纤维二糖为单一碳源的培养基上生长^[13]。Raynal等人克隆了具有分泌β-葡萄糖苷酶能力的克鲁维酵母中的BG基因并成功的在大肠杆菌和酿酒酵母细胞中表达，使酿酒酵母具有一定的水解纤维二糖的能力^[14]。

图1 马克斯克鲁维酵母显微照片

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