利用木糖产乙醇酵母菌的发酵条件优化
2024-01-16 08:20:20
论文总字数：9013字
摘 要
： 以季也蒙假丝酵母JS-73为出发菌株，逐渐增加底物中木糖浓度，对该菌株利用木糖产乙醇的能力进行了驯化，并优化该菌利用木糖生产乙醇的工艺和培养基成分。结果表明，驯化后，木糖利用率为67.21%，酒精产量达到7.41g/L。确定了发酵培养基的最优组合为：木糖60g/L，酵母粉0.6g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，在该条件组合下，菌株JS-73 的乙醇产量为10.27g/L，是理论产量的37.21 %。确定了发酵最优条件为：温度31℃，pH5，转速70r/min，接种量11%，装液量120 mL/250 mL，在此条件下，乙醇产量达最高，为18.95 g/L。关键词：木糖,乙醇,发酵,蒙假丝酵母
Abstract: In the experiment, Pichia guilliermondii JS-73 was used as the starting strain and then cultured to produce ethanol with increasing xylosecontent gradually in the substrate. The results indicated that the utilization rate of xylose was 67.21% and the yield of ethanol was 7.41g/L.
Furthermore, the culture mediums had been optimized and it was composed of 60 g/L xylose, 0.6 g/L yeast powder, 1.0g/L K2HPO4 and 0.4 g/L MgSO4·7H2O. In these conditions, ethanol yield of strain JS-73 reached up 10.27g/L, 37.21 % of theoretical yield. The best fermenting conditions had been determined as follows: temperature at 31℃, pH was 5, rotating speed was 70 r/min, inoculating quantity was 11%, and liquid filling quantity was 120mL/250mL. In these conditions, the yield of ethanol reached up the highest as 18.95g/L.
Keywords: xylose, ethanol,fermentation, Pichia guilliermondii
1 前言
随着人们对全球性能源危机的认识不断深化及环境保护意识的加强[1]，作为石油短缺
大国和消费大国的中国，迫切需要寻找可以替代石油的能源。生物质能因其清洁、可循环再生等优点被认为是最有希望的替代能源之一，作为生物质能源的一种，燃料乙醇已成为减轻石油需求的可替代燃料[2]。巴西、美国、法国等已用甘蔗、玉米大量生产燃料乙醇[3]。在我国，主要以玉米、陈化小麦和稻谷为原料。微生物发酵法生产的燃料乙醇作为一种可再生清洁能源，已经引起了人们的高度重视。
以木质纤维素为原料生产燃料乙醇受到越来越多的关注和研究，木质纤维素的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素混合在一起的材料。在植物纤维素中，纤维素、半纤维素占木质纤维素质量的70%，纤维素和半纤维素必须经过水解分别形成六碳糖和五碳糖后，才能被微生物利用，发酵生产乙醇。天然半纤维素水解产物的85%~90%是木糖。以植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇，能使木质纤维素原料的乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25%。因此，降低纤维乙醇的生产成本，开发更为高效、经济的生产工艺，实现纤维素乙醇的工业化已成为当务之急[4]。实现木糖发酵生产乙醇是决定植物纤维资源生产乙醇经济可行的关键因素。
本实验利用以木糖为唯一碳源筛选得到的季也蒙假丝酵母为出发菌株，对该菌株进行了驯化培养，乙醇产量提高率较为明显，随后又针对此菌株进行营养条件和培养条件的优化，得到高产燃料乙醇菌株。为该菌株在木质纤维素燃料酒精生产工艺中的应用提供了依据和基础。
2 材料与方法
2.1 材料、试剂及仪器
菌种：试验中使用的菌种是从土壤中以木糖液体培养基为筛选培养基分离得到的菌种
（季也蒙假丝酵母JS-73）。木糖固体培养基:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L，琼脂粉20 g/L，pH5。木糖液体种子培养基:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L，pH5。
木糖发酵培养基：木糖60g/L，KH2PO42g/L，酵母粉1g/L，MgSO4·7H2O1g/L，pH5。
酵母木糖驯化培养基：木糖20~70g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，蒸馏水1000 mL，
pH5，115 ℃下灭菌30 min。
仪器：旋转蒸发仪，高压蒸汽灭菌器，数显鼓风干燥箱，培养箱，摇床，超级洁净工作台等。
试剂：酵母浸粉，蛋白胨，木糖，丹磺酰氯，琼脂粉，重铬酸钾，SnC12，高碘酸等。
2.2 试验方法
2.2.1 分析方法
乙醇含量的测定采用重铬酸钾比色法[5]，木糖含量的测定采用丹磺酰氯（DNS）法[6]，
木糖醇含量的测定采用高碘酸比色法[7]。
2.2.2 突变株的驯化
为稳定和提高筛选酵母利用木糖发酵乙醇的能力，将筛选菌株接入酵母木糖驯化培养基驯化培养四轮，并逐步提高发酵液中的初始木糖含量，根据秸秆水解液中木糖含量，将木糖含量的上限控制在7 %，直至菌体适应木糖含量上限。将驯化后的菌株接种发酵，测定其乙醇浓度、残糖浓度及pH值等参数，研究其发酵性能。用灭菌后的接种环挑取2环酵母菌接种至木糖浓度为20 g/L的100 mLYEPD液体培养基中，30℃摇床90 r/min，连续培养96 h，其后以6 %的接种量将菌液接入木糖浓度为30 g/L的液体培养基中，30℃摇床90 r/min，再次连续培养96 h，以此类推直至在木糖浓度为70 g/L的液体培养基中培养完毕，完成菌株的定向驯化。
2.2.3 发酵条件优化
2.2.3.1 氮源的确定
在培养基中添加氮源的种类对菌体代谢木糖有较大的影响，含氮量过高会使副产物增多且会降低酵母菌对乙醇耐受力从而影响乙醇产率。在以木糖为唯一碳源的基础培养基中，添加不同的氮源(其浓度根据培养基中氮元素的摩尔浓度相同进行折算)。碳源包括：酵母粉，蛋白胨、牛肉膏、尿素、乙酸铵、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4。其中，木糖的添加量为2%。挑取一环4℃下保存的菌落于100 mLYEPD 液体培养基中，在30℃和100 r/min 的条件下活化培养18~24 h，将活化好的液体种子接种于每个三角瓶中，接种量为6%。将三角瓶在100r/min 的摇床中30℃下培养96 h。
2.2.3.2 无机盐的优化
以2%木糖、2%最佳氮源加入到基础培养基中，把无机盐进行不同配比，添加在配好的
培养基中，添加量为3%。不同的无机盐配比（以100 mL液体培养基为例）：
a：K2HPO4-MgSO4、b ：K2HPO4-ZnSO4、c：K2HPO4-MnSO4、d：K2HPO4-FeSO4 、e：K2HPO4-CuSO4 、f：K2HPO4-MgSO4-NaCl 、g ： K2HPO4-MgSO4-CaCl2 、h ： K2HPO4-MgSO4-ZnSO4 、i ：K2HPO4-MgSO4-MnSO4、j：K2HPO4-MgSO4-FeSO4、k：K2HPO4-MgSO4-CuSO4。
将活化好的液体种子接种于每个三角瓶中，接种量为6%。将三角瓶在100 r/min 的摇床中30℃下培养96 h。
2.2.3.3 营养条件的正交试验
参照上述单因素的试验结果，对各个因素进行正交优化设计（表1）。
表1 L9（34）正交试验因素水平设计表 (g/L)
水平 | 因 素 | |||
A:木糖 | B:酵母粉 | C:K2HPO4 | D:MgSO4·7H2O | |
1 | 40 | 0.4 | 1.0 | 0.4 |
2 | 50 | 0.5 | 2.0 | 0.5 |
3 | 60 | 0.6 | 3.0 | 0.6 |
2.2.3.4 发酵条件的优化
参照上述营养条件的试验结果，对各个工艺条件因素进行正交优化设计（表2）。
因素 | |||||
A:温度（℃） | B:pH值 | C:转速（r/min） | D:接种量（％） | E:装液量（ml/250ml） | |
1 | 28 | 4.5 | 70 | 5 | 80 |
2 | 31 | 5.0 | 90 | 7 | 100 |
3 | 34 | 5.5 | 110 | 9 | 120 |
4 | 37 | 6.0 | 130 | 11 | 140 |
3 结果与讨论
3.1 驯化结果
通过4 轮的驯化，对菌株驯化结果进行分析，结果见表3。从表3 中可以看出，驯化前后的菌株JS-73 进行发酵性能比较，经过前三轮的驯化得出木糖利用率和乙醇产率都有所提高，在第3 轮驯化后乙醇产率为12.75 %，木糖利用率提高了72.44 %，相较于突变株JS-73乙醇产率提高了1.36 %，木糖利用率调高了11.33 %，第7 轮驯化后发现乙醇产率和木糖利用率都有所降低。
表3 菌株驯化结果
JS-73酵母菌 | 木糖利用率（%） | 乙醇产量（g/L） | 初始pH值 | 最终pH值 |
驯化前 | 42.23 | 4.29 | 5.5 | 3.61 |
驯化1 | 51.26 | 4.56 | 5.5 | 3.23 |
驯化2 | 52.36 | 5.23 | 5.5 | 3.08 |
驯化3 | 54.28 | 5.16 | 5.5 | 2.59 |
驯化4 | 58.93 | 6.54 | 5.5 | 3.14 |
驯化5 | 61.29 | 6.59 | 5.5 | 3.02 |
驯化6 | 64.28 | 7.16 | 5.5 | 3.10 |
驯化7 | 65.24 | 7.26 | 5.5 | 3.08 |
驯化8 | 53.24 | 5.49 | 5.5 | 3.24 |
3.2 不同氮源对乙醇产量的影响
按实验设计方法对不同氮源对乙醇产量的影响进行分析，图1为不同氮源对菌株js-73
乙醇产量的影响结果。
图1 不同氮源对乙醇产量的影响
从图1 中可以看出，在以酵母粉为氮源时，有利于菌体js-73 发酵木糖产生乙醇。以酵母粉为氮源时，乙醇产率比其他氮源都高。确定最佳氮源为酵母粉。
3.3 不同无机盐对乙醇产量的影响
按实验设计方法对不同无机盐对乙醇产量的影响进行分析，图2为不同无机盐对菌株JS-73乙醇产量的影响结果。
a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，k 分别为a：K2HPO4-MgSO4；b：K2HPO4-ZnSO4；c：K2HPO4-MnSO4；d：K2HPO4-FeSO4；e：K2HPO4-CuSO4；f：K2HPO4-MgSO4-NaCl；g：K2HPO4-MgSO4-CaCl2；h：K2HPO4-MgSO4-ZnSO4；i：K2HPO4-MgSO4-MnSO4；j：K2HPO4-MgSO4-FeSO4；k：K2HPO4-MgSO4-CuSO4。
图2 不同无机盐对酒精产量的影响
从图2 中可以看出，在以a（K2HPO4-MgSO4）为无机盐配比方式时，乙醇产率最高，
确定最佳无机盐配比方式。
3.4 营养条件的正交试验
按正交试验因素水平设计对营养条件对乙醇产量的影响进行实验优化，其结果分析见表4。
表4 正交试验因素水平表L9 (34)
试验号 | 因素与水平 | 乙醇产量（g/L） | |||
A | B | C | D | ||
1 | 1（40） | 1（0.4） | 1（1.0） | 1（0.4） | 9.58 |
2 | 1 | 2（0.5） | 2（2.0） | 2（0.5） | 6.68 |
3 | 1 | 3（0.6） | 3（3.0） | 3（0.6） | 5.01 |
4 | 2（50） | 1 | 2 | 3 | 5.68 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 7.29 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 8.79 |
7 | 3（60） | 1 | 3 | 2 | 5.45 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 9.55 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 10.27 |
K1 | 21.27 | 20.71 | 27.34 | 27.26 | |
K2 | 21.34 | 20.12 | 21.25 | 22.36 | |
K5 | 25.26 | 24.36 | 20.12 | 17.54 | |
K1 | 7.12 | 6.25 | 9.56 | 9.46 | |
K2 | 7.26 | 7.25 | 7.89 | 6.99 | |
K5 | 8.52 | 8.12 | 5.46 | 6.25 | |
R | 1.23 | 1.26 | 3.24 | 2.58 | |
顺序 | C＞D＞A＞B | ||||
优水平 | A5 | B5 | C1 | D1 | |
优组合 | A5B5C1D1 | ||||
从表4 中可以看出，A、B、C、D 对乙醇产量的影响顺序是：CDAB，最佳营养条件组合为A3B3C1D1，即木糖60 g/L，酵母粉0.6 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O0.4 g/L。在最佳营养条件组合下，菌株JS-73的乙醇产量为10.27g/L，是理论产量的37.21 %。通过营养条件的优化发现菌株JS-73的乙醇产量提高的不是很多，因此后续可以通过发酵条件的优化来提高菌株JS-73 的乙醇产量。
3.5 发酵条件的优化
按正交试验因素水平设计对发酵条件对乙醇产量的影响进行实验优化，其结果分析见表5。
表5 正交试验因素水平表L16 (45 )
试验号 | A:温度(℃) | B:pH 值 | C:转速(r/min) | D:接种量(%) | E:装液量（ml/250ml） | 乙醇产量(g/L) |
1 | 28 | 4.5 | 70 | 5 | 80 | 7.08 |
2 | 28 | 5 | 90 | 7 | 100 | 6.68 |
3 | 28 | 5.5 | 110 | 9 | 120 | 11.01 |
4 | 28 | 6 | 130 | 11 | 140 | 10.68 |
5 | 31 | 4.5 | 90 | 9 | 140 | 7.29 |
6 | 31 | 5 | 70 | 11 | 120 | 18.95 |
7 | 31 | 5.5 | 130 | 5 | 100 | 9.45 |
8 | 31 | 6 | 110 | 7 | 80 | 12.55 |
9 | 34 | 4.5 | 110 | 11 | 100 | 10.27 |
10 | 34 | 5 | 130 | 9 | 80 | 13.58 |
11 | 34 | 5.5 | 70 | 7 | 140 | 10.68 |
12 | 34 | 6 | 90 | 5 | 120 | 7.01 |
13 | 37 | 4.5 | 130 | 7 | 120 | 7.68 |
14 | 37 | 5 | 110 | 5 | 140 | 10.29 |
15 | 37 | 5.5 | 90 | 11 | 80 | 9.79 |
16 | 37 | 6 | 70 | 9 | 100 | 7.45 |
影响顺序 | B＞C＞A＞D＞E | |||||
优水平 | A2 B2 C1 D4 E3 | |||||
优组合 | A2B2C1D4E3 | |||||
通过2.4 试验结果确定菌株JS-73 最佳营养条件之后，接下来就是菌株JS-73 最佳发酵条件的研究。从表5 可以得出，在A、B、C、D、E 对菌株JS-73 乙醇产量影响顺序为：
Bgt;Cgt;Agt;Dgt;E，最优组合为A2B2C1D4E3，也就是温度为31 ℃，pH5，转速为70 r/min，接种量为11%，装液量为120 mL/250 mL。在此最优条件下，菌株JS-73 发酵木糖产乙醇的产
量为最高18.95 g/L。
结 论
对驯化前后的菌株JS-73 进行发酵性能比较，经过前3 轮的驯化得出木糖利用率和乙醇产率都有所提高，在第3 轮驯化后乙醇产率为12.75%，木糖利用率提高了72.44%，相较于突变株JS-73 乙醇产率提高了1.36%，木糖利用率调高了11.33%，第七轮驯化后发现乙醇产率和木糖利用率都有所降低。不同氮源对菌株JS-73 乙醇产量的影响，以酵母粉为氮源时，有利于菌体JS-73发酵木糖产生乙醇。以酵母粉为氮源时，乙醇产率比其他氮源都高。确定最佳氮源为酵母粉。以a（K2HPO4-MgSO4）为无机盐配比方式时，乙醇产率最高，确定最佳无机盐配比方式。从木糖、酵母粉、K2HPO4、MgSO47H2O 对乙醇产率的影响试验中发现，K2HPO4 是最大的影响因素，确定最佳营养条件组合为A3B3C1D1。在最佳营养条件组合下，菌株JS-73的乙醇产量为10.27g/L，是理论产量的37.21%。通过营养条件的优化发现菌株JS-73的乙醇产量提高的不是很多，因此后续可以通过发酵条件的优化来提高菌株JS-73的乙醇产量。在温度、pH 值、转速、接种量、装液量对菌株JS-73乙醇产量影响试验中，最优组合为A2B2C1D4E3，在此条件下，乙醇产量为最高18.95g/L，该菌株具有较高的木糖和葡萄糖的利用能力，是具有同时发酵葡萄糖和木糖产酒精的天然菌株，显示了该菌株具有较好的研究潜力和应用前景。
参考文献
[1] 刘钺,杜风光,李晓.燃料乙醇生产中杂醇油的综合利用及经济效益分析[J].酿酒科技,2010,
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