论文总字数：6096字

摘 要

从实验室保存的酵母菌中筛选出能够利用木糖发酵产L-乳酸的菌株，并采用单因素试验粗略的分析其较优的培养条件。初步确定为摇床转速180r/min、温度32℃、250ml摇瓶装液50ml、接种量12%。

关键词：酵母菌、筛选、木糖、L-乳酸、优化

Abstract：From yeast extract can be preserved in our laboratory, use of xylose fermentation strains of L - lactic acid production, and USES the single factor experiment rough analysis of the optimal culture conditions. Initially identified as table speed 180 r/min, temperature 32 ℃, 50 ml 250 ml shake bottled liquid, quantity of 12%.

Keywords：Yeast, screening, xylose, L - lactic acid, optimization

1 前言

1780年，乳酸首次被人们发现。这种古老而重要的有机酸，现今已广泛应用于食品、医药、农业和化工等各个方面^[5]。当前，L-乳酸也可以作为原料大规模地应用于氧化化学品、可生物降解塑料、绿色化学品和溶剂，以及植物生长调节剂等方面^[7]。聚乳酸(PLA)是一种可降解的高分子材料，它是由L-乳酸经过聚合生成的，具有无毒、无刺激性、强度高、可塑性好、生物相容性优良等特点^[4]，可以用来制造生物可降解塑料、绿色包装材料和药用修复材料等。如果聚乳酸能够广泛应用的话将对解决越来越严重的“白色污染”问题有很大帮助，应用前景十分广阔，并且具有较好的经济效益和社会效益。因此，无论国内国外都对L-乳酸的生产研究非常重视。

目前,乳酸发酵生产的最大原料来源是淀粉等粮食作物^[1]。但使用粮食作物生产乳酸会大量消耗粮食资源,而且会使的乳酸成本居高不下,从而对于聚乳酸在环保领域的应用产生很大限制^[1]。如果利用植物纤维为原料发酵生产乳酸,不但可以降低乳酸的生产成本，而且可以使粮食紧缺局势得到缓解^[8]。木质纤维素经过各种处理后，可以得到C源充足的水解液（主要由葡萄糖和木糖组成）。葡萄糖作为一种基本C源可以被绝大多数的微生物所利用，然而却只有很少一部分天然微生物能有效利用木糖并将其高效代谢为经济适用的产品^[13]。为了能充分利用木质纤维素酸水解液或酶水解液中的C源，微生物不仅要能高效利用葡萄糖而且还要求能高效利用木糖^[13]。

目前自然界存在着的包括细菌、酵母菌和丝状真菌（主要为米根霉）等某些能够利用木糖的天然微生物^[3]。

天然微生物中能够利用木糖酵母菌发酵产乳酸的代谢途径，首先是利用依赖NADPH的木糖还原酶（Xylose reductase，XR）作用将木糖还原得到木糖醇，然后由依赖NAD 的木糖醇脱氢酶（Xylitol Dehydrogenase，XDH）作用将木糖醇氧化为木酮糖，接着通过木酮糖激酶（Xylulokinase）磷酸化形成5-磷酸木酮糖，然后便进入磷酸戊糖途径（Pentose Phosphate Pathway，PPP）^[3]。磷酸戊糖途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，丙酮酸再经L-乳酸脱氢酶以NADH为辅酶还原为L-乳酸。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因为缺乏使木糖转化为木酮糖的酶，所以无法利用木糖，但是木糖的异构体—木酮糖却可以被利用^[3]。在酿酒酵母菌中木酮糖也是先磷酸化形成5-磷酸木酮糖，进入PPP途径，经酵解形成乳酸^[3]。

本文主要讲述从实验室储藏的酵母菌中筛选出能高效利用木糖发酵L-乳酸的菌株并采用单因素试验法初步分析优化其培养条件。

2 材料与方法

2.1 菌种与培养基

所选菌种为生命科学学院实验室内储藏的酵母菌

平板培养基：ypd培养基

筛选培养基：将ypd培养基中的葡萄糖成分替换成木糖

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100、木糖50、(NH₄)₂SO₄ 3.0、KH₂PO₄ 0.3、

ZnSO₄·7H₂O 0.4、MgSO₄·7H₂O 0.3、CaCO₃ 60(单独灭菌)，pH值自然^[4]。

以上培养基均121℃高温灭菌15min。

2.2 指标检测方法

2.2.1 L-乳酸产量的测定

采用EDTA定钙法测定^[7]。EDTA定钙法是以络合反应为基础的测定乳酸含量的方法，它依据发酵液中的乳酸与过量的CaCO₃形成乳酸钙后，用EDTA标准溶液滴定乳酸钙中所含有的钙，通过发酵液中乳酸与钙定量反应的关系，间接计算出乳酸含量。

2.2.2 发酵液中残糖含量的测定

采用HPLC（高效液相色谱法）。检测条件：Waters e2695色谱仪，色谱柱为Waters Carbohydrate Analysis Column(3.9mm ×300mm)；检测器：Waters 2424(ELS检测器)；进样量：10μL；流动相流速：1mL/min；流动相：75%乙腈、25%水；柱温：30℃。

2.2.3 生物量的测定

菌体干质量法

2.3 酵母菌筛选

将配制好的ypd培养基高温灭菌后分装到5个平板中，待其冷却凝固。取出冷藏室内储存的酵母菌试管。在无菌操作台中采用平板划线法将酵母菌接种到平板上。置于27℃烘箱中培养48h。

将配制好的筛选培养基分装到15个250ml三角瓶中。取出烘箱中培养的平板置于无菌操作台内。仔细挑取长势良好、菌落直径比较大的菌落接入三角瓶内，每个平板接3个三角瓶。置于30℃摇床中培养48h。取出观察酵母菌长势，其中有3瓶有可见的酵母菌生长。对其进行L-乳酸含量和残糖含量等指标的测定从而得到发酵木糖产乳酸最为高效的菌株。并采用此菌株进行下面的培养条件优化实验。

2.4 培养条件优化

发酵条件单因素试验

因为秸秆水解液中木糖与葡萄糖的质量比近似于1：2，所以本试验的发酵培养基中以质量比1：2的比例添加木糖与葡萄糖；培养基组分是由前期实验（培养基优化实验）得到的较适添加量配制发酵培养基^[4]。对摇床转速、发酵温度、装液量、接种量各因素进行单因素试验，以确定主要影响因素及水平区间^[4]。试验结果的差异显著性分析采用F检验（方差齐性检验）。

3 结果与分析

几种发酵条件分别对该酵母菌发酵产L-乳酸效果的影响

3.1 摇床转速的影响

因为酵母菌的乳酸发酵是好氧过程，所以摇床转速会对发酵液中的溶氧传质速率产生影响^[4]。根据上一节的摇瓶发酵培养条件，分别取摇床转速为120、150、180、210、240r/min时测量发酵得到的L-乳酸产量，结果见图1。

通过图1可知，在180r/min振荡培养的条件下L-乳酸产量高于其他转速培养。因此，可以初步确定摇床转速为180r/min。对该因素进行方差分析，得到P=6.8×10^-5＜0.01，说明摇床转速因素对L-乳酸产量有极显著影响。

3.2 温度的影响

温度会对细胞生长与代谢过程中的酶活性产生影响，从而影响发酵过程。选择摇床转速为180r/min，其他培养条件同上，考察温度为28～34℃的范围内酵母菌发酵产L-乳酸的产量，结果见图2。

通过图2可知，随着发酵温度的升高，L-乳酸产量也相应增大，但存在一个最适温度，超过这一温度，L-乳酸产量就会有所下降，这是由于酶活性而影响的结果。当温度为32℃时发酵产L-乳酸水平最高，所以初步确定最适发酵温度为32℃。对该因素进行方差分析，得到P=0.029286＜0.05，说明温度因素对L-乳酸产量有显著影响。

3.3 装液量的影响

关于酵母菌发酵产L-乳酸的过程，前期的菌体生长阶段是以好氧为主，而后期的发酵生产阶段则以厌氧为主^[4]。装液量的不同会改便摇瓶的通气量从而影响酵母菌发酵产乳酸水平。选择摇床转速180r/min、温度32℃，其他培养条件同上，考察不同装液量下L-乳酸的产量，结果见图3。

通过图3可知，250mL的摇瓶当装液量为50mL时，L-乳酸的产量最高，故初步确定50mL为最佳装液量。对该因素进行方差分析，得到P=0.00028＜0.01，说明装液量因素对L-乳酸产量有极显著影响。

3.4 接种量的影响

通过采用适当的接种量可以缩短菌体生长达到高峰的时间，从而使产物的合成提前。如果接种量过少，会导致菌体生长缓慢，延长发酵周期，不利于菌株高产L-乳酸。如果接种量过大，会导致菌体生长过快、培养液黏度增加，营养物质消耗过快，则菌体早衰，造成发酵后劲不足，从而对产酸量及转化率起负面影响^[4]。选择摇床转速180r/min、温度32℃、装液量50mL，取接种量为6%、8%、10%、12%、14%五个水平，培养72h，分别进行摇瓶发酵实验，观察接种量对发酵L-乳酸的影响，结果见图4。

通过图4可以看出，当接种量过小时，L-乳酸产量低；逐步提高接种量会是L-乳酸产量提高；但当接种量达到12%以后，再加大接种量，也无法使产酸量得到显著提高。考虑到生产过程中的种子培养成本^[4]，所以选择12%的接种量较为合适。对接种量因素进行方差分析，得到P=1.72×10^-8＜0.01，说明该因素对L-乳酸产量有极显著影响。

结 论

通过发酵条件的单因素试验，确定了摇床转速、温度、装液量和接种量为影响该酵母菌发酵产L-乳酸的显著性因素。

实验结果表明，最佳产酸条件为：培养基成分：木糖50g/L、葡萄糖100g/L、(NH₄)₂SO₄3.0g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L；环境因素：摇床转速180r/min、温度32℃、接种量12%、装液量50mL，该条件下L-乳酸产量平均值为116.54g/L。

参 考 文 献

[1]江均平,张秀凤,王金静,李正英.一株利用木糖产L-乳酸细菌的发酵特性研究[J].食品与发酵工业,2009,35(6):10-17.

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