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摘 要

该实验在单因素条件下对重组马克斯克鲁维酵母产纤维素酶的液体培养基进行优化，主要改变培养基的碳源，氮源，生物素浓度和初始pH值使重组马克斯克鲁维酵母产纤维素酶酶活达到最优。通过滤纸酶活测定纤维素酶活力得到在20 g/L α-乳糖，20 g/L 乙酰胺，150 mg/L生物素，用柠檬酸缓冲溶液（0.05 M、 pH 4.8）配制并调节到7.0的培养条件下产出的纤维素酶酶活力最高。

关键词：马克斯克鲁维酵母，纤维素酶，培养条件优化

Abstract: The experiment under single factor recombinant Kluyveromyces marxianus broth cellulase production optimization,the main changes in carbon, nitrogen, biotin concentration and initial pH value of the medium of the recombinant Kluyveromyces marxianus produce cellulase activity reached optimum. Cellulase activity obtained at 20 g / L α- lactose, 20 g / L acetamide, 150 mg /L, formulated with citric acid buffer solution (0.05 M, pH 4.8) and adjusted to the culture conditions 7.0 Determination by filter paper activity under highest output of cellulase enzyme activity.

Keywords：Kluyveromyces marxianus，Cellulase，Optimization of culture conditions

目录

1 前言 6

2 实验材料 6

2.1 菌种 6

2.2 培养基与试剂 6

2.3 主要仪器与设备 6

3 实验方法 7

3.1 初始pH值优化 7

3.2 培养基碳源优化 7

3.3 培养基氮源优化 7

3.4 生物素浓度优化 7

3.5 重组菌酶活测定 8

4 结果与讨论 8

4.1初始pH值优化 8

4.2 YPG培养基碳源优化 8

4.3 YPG培养基氮源优化 9

4.4 生物素浓度优化 10

4.5最佳产酶条件优化结果 11

结论 12

参考文献 13

致谢 14

1 前言

在矿物质能源紧缺的今天，除了节约能源和寻找替代资源外，更应该可持续的利用有限的资源。生物能源恰好是人类最主要的可再生能源之一，能通过生物的活动，将生物质、水或其他无机物转化为沼气、氢气等可燃气体或乙醇、油脂类可燃液体为载体的可再生能源。那么，如何更好地利用生物能源成为关键性的问题。生物能源利用最主要的问题就是纤维素的降解。为了更好的利用纤维素，则需要大量的纤维素酶，但是纤维素酶的应用成本相对较高^[1-2]，如何开发低成本的纤维素酶仍在探索中。本实验的目的就是想通过优化重组马克斯克鲁维酵母产纤维素酶培养条件来找到该菌株的最佳产酶条件，从而为后期的大规模生产纤维素酶奠定基础。

纤维素酶是降解产生纤维素的一组酶的总称，能降解和利用纤维素的微生物大致可分为真菌类和细菌类。 纤维素酶包括内切葡聚酶（EG）、外切葡聚酶（CBH）和 β -葡萄糖苷 酶（BG）三种酶 ^[3-4]。木质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在，而外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶，在木质纤维素降解成还原糖的过程中，外切葡聚糖酶起着非常关键的作用^[5]。

本课题研究的重组马克思克鲁维酵母是通过基因工程的技术，人工合成里氏木霉的外切葡聚糖酶基因，导入马克斯克鲁维酵母中, 利用酵母生长快、蛋白分泌能力强、易于培养等特点^[6]，使外切葡聚糖酶基因能够在常温和短时间内快速、超量表达，达到降低能耗和提高经济效益的目的。

2 实验材料

2.1 菌种

成功表达里氏木霉基因的马克斯克鲁维酵母重组菌株。

2.2 培养基与试剂

YPG液体培养基：酵母粉10 g /L，蛋白胨20 g /L，α-乳糖 20 g /L。

柠檬酸缓冲液：柠檬酸 210g/L，调节pH至3.8，然后按1：19比例稀释至pH值为4.8。

2.3 主要仪器与设备

2S-75HJ型高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司

HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司

EPED-E2-10TF纯水仪：南京易普易达科技发展有限公司

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司

SPX-250B生化培养箱：上海佳胜实验设备有限公司

电子天平BS210S：北京赛多利斯天平有限公司

高速冷冻离心机HR21M：湖南赫西仪器设备有限公司

HD-930DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司

ZF1-Ⅰ多功能紫外分析仪：上海汗诺仪器有限公司

HD-930型组合式全温摇床：太仓市博莱特实验仪器厂

3 实验方法

3.1 初始pH值优化

YPG培养基的pH值默认为6.8，而里氏木霉的最适pH值一般在4.0 到6.0之间，在pH为 8.0时酶活力可能受到影响。有报道指出里氏木霉表达系统在不同的初始pH值下表达不同的外源蛋白差异显著。因此我们调整YPG培养基的初始pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分别测定上清酶活，以确定最适初始pH值。

3.2 培养基碳源优化

我们观察到YPG培养基中的α-乳糖浓度对重组马克斯克鲁维酵母向培养液中分泌的重组酶活力和蛋白产量影响很大，因此我们在YPG培养基中尝试使用不同的α-乳糖浓度，10，15，20，25和30 g/L，接种培养后分别测定上清酶活，以确定最适的α-乳糖浓度以及对重组细胞生长的影响。

3.3 培养基氮源优化

基于同样的原因，我们对YPG培养基中的氮源乙酰胺的浓度进行了优化，分别加入16、18、20、22、24和26 g/L 乙酰氨，测定上清的马克斯克鲁维酵母酶活，以确定最佳的乙酰胺浓度以及它对重组细胞生长的影响。

3.4 生物素浓度优化

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